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Cell重磅，Hi-C測(cè)序揭示中介體的結(jié)構(gòu)和功能

信息來(lái)源：金開(kāi)瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2019-09-23 11:34:22

題目：A Pliable Mediator Acts as a Functional Rather Than an Architectural Bridge between Promoters and Enhancers

期刊：Cell

影響因子：36.2

主要技術(shù)：CRISPR-Cas9，degron，Hi-C，cryo-EM

研究背景

多亞基中介體復(fù)合物在真核生物RNA聚合酶II（Pol II）的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用。中介體通過(guò)未知的機(jī)制將功能信息從與增強(qiáng)子結(jié)合的TF（Transcription factor）傳遞到啟動(dòng)子的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制中。中介體各種亞基的突變導(dǎo)致人類(lèi)基因表達(dá)的顯著缺陷和人類(lèi)疾病。雖然只有一小部分后生動(dòng)物特異性亞基被報(bào)道出對(duì)體外轉(zhuǎn)錄和胚胎發(fā)育至關(guān)重要，但是它們的保守性表明它們可能有助于增強(qiáng)高等生物體中轉(zhuǎn)錄調(diào)控的復(fù)雜性。

研究結(jié)果

1、mMED的EM分析

為了研究mMED結(jié)構(gòu)和亞基組織，包括后生動(dòng)物特異性亞基的位置，作者使用cryo-EM獲得復(fù)合物的亞納米分辨率圖。從CH12小鼠B細(xì)胞免疫純化mMED，其中通過(guò)CRISPR-Cas9在MED19的N末端標(biāo)記FLAG。對(duì)163,184個(gè)所選圖像對(duì)準(zhǔn)參數(shù)的最終改進(jìn)（來(lái)自20個(gè)傾斜顯微照片的20％），得到總分辨率為5.9A°的mMED低溫-EM圖（圖1A）。作者證實(shí)除較大的MED14 C末端外，核心mMED亞基的相對(duì)排列與酵母核心中介體有顯著的相似性（圖 1B）。基于與Sp Mediator的同源性，作者通過(guò)確定mMED中的頭部，中部和MED14的邊界，確定了哺乳動(dòng)物結(jié)構(gòu)中的所有非核心密度（圖1C）。在mMED中，MED14 C末端參與尾部錨定，但核-尾界面相當(dāng)廣泛和復(fù)雜，其中包括尾部與頭部、中部之間的額外接觸（圖1C）。

Figure 1. mMED Cryo-EM Map and Module Organization

2、哺乳動(dòng)物尾部模塊的布置和結(jié)構(gòu)

mMED尾部分為兩個(gè)連接的段。較小的一個(gè)（基于其在低溫EM圖中的體積165 kDa）與頭部鉗口鄰接并且圍繞MED14 C末端包裹。第二個(gè)較大的尾段（380 kDa）對(duì)應(yīng)于Sc尾模塊（圖1C）。作者將亞基缺失和標(biāo)記與EM成像相結(jié)合，以揭示特定尾部亞基的位置。觀察哺乳動(dòng)物和酵母尾部之間的結(jié)構(gòu)同源性以及MED23-MED24-MED16尾部子模塊表明，較大尾部的中間部分的密度與MED16相對(duì)應(yīng)。3D差異分析顯示MED25占據(jù)大尾段的中心位置，其楔入MED16，MED23和MED24 N末端的交叉點(diǎn)。這與人類(lèi)中介體中尾部亞基相互作用的生化分析一致，證實(shí)了MED25與MED16，MED23和MED24之間廣泛的相互作用。

與yMED相比，后生動(dòng)物特異性亞基的存在導(dǎo)致尾核界面更加擴(kuò)展，涉及更多的模塊間接觸并導(dǎo)致穩(wěn)定的構(gòu)象。尾部是TF的主要目標(biāo)，其增加的復(fù)雜性可能為高等真核生物中更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)提供機(jī)會(huì)（圖2）。

Figure 2. mMED Tail Structure, Subunit Orga nization, and Core Interactions

3、mMED基因分析

為了研究mMED結(jié)構(gòu)的功能意義，作者對(duì)小鼠細(xì)胞中的中介體進(jìn)行了全面的遺傳分析。作者使用CRISPR-Cas9，以T細(xì)胞（原代和EL4），B細(xì)胞（CH12）和胚胎干細(xì)胞（ESC）中的33個(gè)亞基為靶向，分析了總共16,399個(gè)靶向克隆。值得注意的是，B，T和ESC之間的遺傳篩選率為88％（33個(gè)中的29個(gè)）（圖3A）。總的來(lái)說(shuō)，其中15個(gè)亞基對(duì)所有細(xì)胞類(lèi)型的生存能力至關(guān)重要，而另外14個(gè)亞基可以是純合缺失的（圖3A）。

在真核生物中，大多數(shù)mMED核心亞基的基本性質(zhì)是一致的，就是保護(hù)核心Mediator和PIC結(jié)構(gòu)。同時(shí)，作者的結(jié)果暗示哺乳動(dòng)物細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)錄和整體生存力要求酵母或最小核中無(wú)中介體亞基。

Figure 3. mMED Genetic and Functional Analysis

4、mMED核心亞基的功能分析

作者應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)試不屬于尾部的非必需亞基在體內(nèi)作用，發(fā)現(xiàn)每次敲除中僅有相對(duì)少量的基因受影響（圖3B）。為了確定由mMED調(diào)節(jié)的全部基因，作者將MED14主鏈與自我切除的丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶 - degron（SMASh [小分子輔助關(guān)閉]）融合（圖3C）。研究結(jié)果支持中介體穩(wěn)定PIC并促進(jìn)CTD磷酸化的觀點(diǎn)。因此，與調(diào)節(jié)一部分基因表達(dá)的非必需中介體亞基相反，完整復(fù)合物是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中全局Pol II募集和轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增所必需的。相反，至少在短期內(nèi)，表觀遺傳可及性不需要中介體（圖3E）。

5、mMED尾部模塊的功能分析

mED14-degron的一個(gè)限制是它無(wú)法區(qū)分中介體在啟動(dòng)子激活Pol II的作用與其作為增強(qiáng)子結(jié)合TF的停靠位點(diǎn)的作用。當(dāng)尾部不存在時(shí)，Pol II活性在整個(gè)基因組中受到輕微影響，單敲除沒(méi)有顯示出這種表型。受影響基因的啟動(dòng)子平均與10個(gè)H3K27Ac + H3K4me1 +增強(qiáng)子相關(guān)，而未受影響的基因的啟動(dòng)子為6個(gè)（p <2.2e16）（圖4C）。這支持了mMED尾部在TF和Pol II之間創(chuàng)建功能橋梁的概念。

Figure 4. Tailless Mutant and Effect of MED1 and Tail Subunit Deletions on mMED Interaction with Pol II and CKM

6、中介體-POL II和中介體-CKM相互作用的尾部調(diào)節(jié)

該領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是中介體如何促進(jìn)Pol II的TF激活，首先，尾部突變體的Cryo-EM分析發(fā)現(xiàn)MED15，MED16，MED24或MED23-MED24-MED25的缺失使尾部模塊或其與核心的相互作用不穩(wěn)定（圖4D），這是由于缺乏相應(yīng)的尾部亞基，而不是由于移動(dòng)性增加而未能檢測(cè)到它們的密度。TF和尾部亞基之間的相互作用可能影響尾部結(jié)構(gòu)，因此影響其與核心的相互作用。其次，尾部完整性或與核心相互作用的缺失會(huì)對(duì)中介體的相互作用產(chǎn)生巨大影響。后生動(dòng)物特異性亞基可能通過(guò)對(duì)介體結(jié)構(gòu)和構(gòu)象的進(jìn)一步影響而影響介體相互作用。

7、中介體在啟動(dòng)子-增強(qiáng)子相互作用中的作用

在穩(wěn)定染色質(zhì)環(huán)的情況下TF與中介體的尾部接觸，啟動(dòng)子與同源增強(qiáng)子（P-E）相連接。為了直接評(píng)估P-E接觸是否需要中介體，作者在幾乎無(wú)mMED的B細(xì)胞中原位進(jìn)行Hi-C。作者認(rèn)為，P-E的相互作用持續(xù)存在于中介體和Pol II急劇耗盡的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。為了評(píng)估中介體-Pol II或黏連蛋白對(duì)P-E接觸的貢獻(xiàn)，應(yīng)用啟動(dòng)子捕獲Hi-C（PCHi-C）。研究表明即使沒(méi)有CTCF環(huán)，中介體和Pol II對(duì) PP或PE的相互作用也沒(méi)有明顯的貢獻(xiàn)，中介體和Pol II都不需要橋連接來(lái)調(diào)節(jié)DNA（圖5和圖6）。

Figure 5. P-E Interactions Are Largely Imper[1] vious to Acute Removal of Mediator and Pol II but Dependent on Cohesin

Figure 6. Analysis of Mediator-Pol II Degron

8、MED突變細(xì)胞的長(zhǎng)期結(jié)構(gòu)變化

作者認(rèn)為中介體和Pol II可能是通過(guò)使環(huán)狀結(jié)構(gòu)域變得可接近結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，間接影響染色質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。作者檢測(cè)無(wú)尾部細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P-E接觸在受影響的基因座的轉(zhuǎn)錄上升或下降后增加或減少（圖7A）。相比之下，當(dāng)黏連蛋白耗盡時(shí)，P-E接觸減少50％（圖7A）。在少數(shù)情況下，整個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)域丟失或獲得（圖7B和7C），表明無(wú)尾細(xì)胞的拓?fù)浔硇褪情g接的。中介體尾部缺失對(duì)染色質(zhì)相互作用的影響可能是由于細(xì)胞增殖時(shí)結(jié)構(gòu)蛋白募集的下游變化，DNA甲基化和可能的其他表觀遺傳標(biāo)記起著可及性作用。因此，雖然中介體和Pol II在啟動(dòng)子和增強(qiáng)子之間建立了一個(gè)功能橋梁，但它們?cè)?D中的接近度并不是絕對(duì)必需的。

Figure 7. The Impact of Mediator Tail Deletion on Promoter-Enhancer Interactions

總結(jié)

雖然中介體在真核轉(zhuǎn)錄中起關(guān)鍵作用，但對(duì)其作用機(jī)制知之甚少。該研究結(jié)合了CRISPR-Cas9基因篩選，degron，Hi-C和低溫電子顯微鏡（cryo-EM）來(lái)剖析哺乳動(dòng)物中介體（mMED）的功能和結(jié)構(gòu)。 B細(xì)胞、T細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞（ESC）中的缺失分析確定了Pol II募集全基因組所需的核心亞基。相反的，喪失非必需亞基主要影響啟動(dòng)子與多種增強(qiáng)子的連接。與目前的模型相反，束縛調(diào)節(jié)DNA時(shí)mMED和Pol II是不必要的。Cryo-EM分析顯示非必需亞基增加了尾部模塊的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，尾部模塊是主要的轉(zhuǎn)錄因子靶標(biāo)。尾部結(jié)構(gòu)的變化顯著增加Pol II和激酶模塊的相互作用。作者提出中介體的結(jié)構(gòu)柔韌性使其能夠整合和傳遞調(diào)控信號(hào)，在啟動(dòng)子和增強(qiáng)子之間充當(dāng)功能者而非橋梁。

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