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【客戶文章分享】利用基于iTRAQ-PRM的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究辣椒對(duì)煙粉虱的抗性機(jī)制

信息來(lái)源：金開(kāi)瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2020-06-01 16:30:55

題目：Proteomic analysis by iTRAQ-PRM provides integrated insight into mechanisms of resistance in pepper to Bemisia tabaci

期刊：BMC PLANT BIOLOGY

合作技術(shù)：iTRAQ、PRM

研究背景

煙粉虱是辣椒的主要食葉害蟲(chóng)，對(duì)辣椒的生長(zhǎng)和產(chǎn)量造成嚴(yán)重?fù)p害。因此，研究辣椒對(duì)煙粉虱的抗性機(jī)理，育種和推廣辣椒對(duì)煙粉虱的抗性品種尤為重要。然而，關(guān)于植物如何感知和防御害蟲(chóng)的分子機(jī)制非常有限。蛋白質(zhì)組技術(shù)為研究植物對(duì)抗煙粉虱的生理反應(yīng)所涉及的分子機(jī)制提供了一些見(jiàn)解。

技術(shù)路線

圖1

研究人員先通過(guò)篩選，挑選出了對(duì)煙粉虱高抗性和敏感性的植株；后將兩種植株在煙粉虱環(huán)境下培養(yǎng)了48h，發(fā)現(xiàn)兩種植株存在不同的表型差異；接著，研究人員利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，找到了差異表型下的差異蛋白；然后通過(guò)生物信息學(xué)分析，分析了這些差異蛋白的生物學(xué)功能；最后，研究人員利用RT-PCR和基于質(zhì)譜的PRM技術(shù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行了驗(yàn)證。根據(jù)上述結(jié)果，分析討論了辣椒對(duì)煙粉虱的抗性的機(jī)理。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、煙粉虱處理后的表型變化

在初步實(shí)驗(yàn)中，作者篩選了許多辣椒材料，并鑒定出兩個(gè)辣椒基因型變種，它們顯示出對(duì)煙粉虱的高抗性（RG）或敏感性（SG）。對(duì)兩種基因型的抗性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高抗性(RG)的辣椒葉片呈深綠色，而敏感型(SG)的辣椒葉片呈淺綠色。兩個(gè)品種間成年煙粉虱的沉降行為不同。煙粉虱在SG上的種群數(shù)量是在RG上的40倍左右。同樣，SG的卵孵化率較高，而RG的卵孵化率較低(圖2c)。因此，這兩種基因型是研究辣椒對(duì)煙粉虱侵染的蛋白質(zhì)組學(xué)機(jī)制的理想選擇。

圖2

2、iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

作者利用itraq定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較了正常組(RC)、高抗組（RG）、敏感組（SG）辣椒葉片在感染煙粉虱前后的蛋白差異表達(dá)情況，共鑒定了20,102個(gè)肽和2756個(gè)蛋白（至少兩個(gè)高置信度的特征性）。比較組RC-SC、RB-RC、SB-SC差異蛋白韋恩分析結(jié)果如下圖所示：在3個(gè)比較組中總共統(tǒng)計(jì)到了115種蛋白發(fā)生差異變化，其中有24種差異蛋白是高抗性品種中所特有的。

圖3

在找到這些差異蛋白之后，作者進(jìn)一步對(duì)差異蛋白進(jìn)行了功能分析。發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要參與代謝過(guò)程，細(xì)胞過(guò)程，對(duì)刺激的反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。結(jié)合差異蛋白的上下調(diào)關(guān)系，作者認(rèn)為細(xì)胞壁蛋白在內(nèi)的相關(guān)蛋白提高了辣椒對(duì)煙粉虱病的耐受性，此外光合作用相關(guān)蛋白在辣椒對(duì)煙粉虱的抗性中也起重要作用。

圖4

為了進(jìn)一步理清這些相關(guān)蛋白的上下游聯(lián)系，作者分析了這些蛋白所參與的信號(hào)通路。通過(guò)KEGG通路聚類(lèi)分析，作者發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白多聚類(lèi)在碳固定、亞麻酸代謝、光合作用等相關(guān)信號(hào)通路。根據(jù)GO功能和KEGG途徑分析，作者認(rèn)為參與刺激反應(yīng)，抗氧化劑防御，光合作用和亞油酸代謝的多種蛋白質(zhì)可能對(duì)煙粉虱的損害具有防御作用。

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

基于質(zhì)譜的分析結(jié)果，作者在基因水平上采用了RT-PCR技術(shù)去驗(yàn)證差異蛋白的表達(dá)情況。在挑選的6個(gè)基因中，其中有4個(gè)基因的表達(dá)水平與蛋白變化一致，還有兩個(gè)存在差異，這種差異可能歸因于mRNA穩(wěn)定性，內(nèi)源性剪接，翻譯調(diào)控，翻譯后加工，蛋白質(zhì)更新控制，蛋白質(zhì)降解等等因素影響所致。

圖5

作者近一步挑選了與抗性相關(guān)的10個(gè)蛋白進(jìn)行了PRM驗(yàn)證，其中，有8種具有MS /MS光譜和獨(dú)特的肽，能夠在質(zhì)譜中被驗(yàn)證。通過(guò)PRM驗(yàn)證，作者發(fā)現(xiàn)其變化趨勢(shì)與iTRAQ結(jié)果基本一致，驗(yàn)證了iTRAQ結(jié)果的可靠性。

圖6

實(shí)驗(yàn)小結(jié)

本文通過(guò)iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，尋找了高抗性、敏感性及正常辣椒植株間，在煙粉虱侵染后的差異蛋白表達(dá)變化，找到了與抗性相關(guān)的一些關(guān)鍵蛋白和信號(hào)通路。然后借助PRM等技術(shù)手段，驗(yàn)證了組學(xué)結(jié)果的可靠性。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和已有文獻(xiàn)報(bào)道，提出了提高光合作用能增添植株煙粉虱抗性，植物防御代謝物的合成需要固定碳或增加光合活性，以彌補(bǔ)昆蟲(chóng)對(duì)葉面積的損失的觀點(diǎn)。闡述了煙粉虱侵染辣椒后的防御反應(yīng)機(jī)制，為辣椒煙粉虱病蟲(chóng)害的防治和辣椒的育種提供的新的方向。

相/關(guān)/服/務(wù)

iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）是一種體外同重同位素標(biāo)記的相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)，利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度質(zhì)譜儀串聯(lián)分析，可同時(shí)比較多達(dá)8種樣品之間的蛋白表達(dá)量，是近年來(lái)定量蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用最廣泛的高通量篩選技術(shù)。

金開(kāi)瑞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)提供iTRAQ定量蛋白質(zhì)組技術(shù)服務(wù)，具有靈敏度高、分離能力強(qiáng)、高通量等特點(diǎn)，已協(xié)助客戶在Advanced Materials等期刊雜志發(fā)表多篇文章，單篇影響因子高達(dá)19+！

靶向蛋白質(zhì)組PRM（平行反應(yīng)監(jiān)測(cè), Parallel Reaction Monitoring），是一種基于高分辨、高精度質(zhì)譜的靶向定量技術(shù)，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)/肽段（以及含有修飾的肽段）進(jìn)行選擇性檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段的精準(zhǔn)定量。靶向蛋白質(zhì)組掃描就像精準(zhǔn)狙擊，排除干擾，目標(biāo)明確。

四級(jí)桿（Q1）首先選出的目標(biāo)肽段離子，進(jìn)入碰撞室中打碎后，所有的碎片離子經(jīng)過(guò)質(zhì)量分析器產(chǎn)生一張高分辨的二級(jí)質(zhì)譜圖，通過(guò)提取其中的碎片離子信息即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)肽段的定量。

金開(kāi)瑞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺(tái)提供靶向蛋白質(zhì)組PRM技術(shù)服務(wù)，具有定量準(zhǔn)確、高通量、可同時(shí)監(jiān)測(cè)50-100個(gè)分析物、高靈敏度和高重現(xiàn)性的特點(diǎn)。

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