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知無不“研”|一文讀懂酵母單/雙雜交

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2020-06-01 16:01:22

一、酵母單雜交

酵母單雜交技術是在酵母雙雜交基礎上發展而來的一種研究核酸-蛋白相互作用的工具，被廣泛用于研究真核細胞內基因的表達調控，如鑒別DNA結合位點發現潛在的結合蛋白基因、分析DNA結合結構域信息等。

二、酵母雙雜交

酵母雙雜交及系統是一種鑒定和檢測蛋白質相互作用的研究方法，因其具有靈敏度高、功能強大、適用范圍廣等特點，現已被應用于多個研究領域。

核蛋白酵母雙雜交：

核蛋白酵母雙雜交技術最初由Fields等人在研究酵母轉錄因子GAL4性質時建立，后續經過不斷改進已發展成為一種成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有簡便、靈敏、可反映蛋白在活細胞內互作真實情況的特點，被廣泛應用于互作蛋白的篩選、蛋白相互作用的鑒定/驗證、蛋白互作機理的探究、蛋白連鎖圖譜繪制等工作。

膜蛋白酵母雙雜交：

DUALmembrane技術在傳統的酵母雙雜交系統的基礎上，巧妙地利用分離的泛素系統（split-ubiquitin）進行蛋白質相互作用的篩選；泛素作為降解信號分子，人為分成兩部分：N端（Nub），C端（Cub），互補重構的完整泛素分子可被泛素專一性蛋白酶（UBPs）識別，從而導致與泛素相連的蛋白被酶解。

多領域的研究利器

植物：自交不親和機理研究……

病毒：朊蛋白、病毒蛋白相互作用蛋白篩選……

信號通路：轉錄因子、雌激素α受體相互作用蛋白篩選……

癌癥醫學：癌癥相關蛋白、凋亡相關蛋白相互作用蛋白篩選……

寄生蟲醫學：毒力因子致病機制研究、半乳糖凝集素互作蛋白篩選……

基礎原理研究：肌球蛋白、蛋白酶體調節因子相互作用蛋白篩選、受精卵發育……

獨特的技術優勢

一站式輔助檢測手段方便快捷，得到可靠的實驗結論；多年文庫構建經驗，4種優化的Total RNA提取技術方案可以有效保證Total RNA的純度和完整性，保證樣本的多樣性；

高效的SM定向三框文庫構建技術可以保證文庫的陽性率在98%以上，且一份cDNA樣本連接三個不同的讀碼框載體可以輕松實現三框文庫的質控指標零差異，減少文庫差異對篩選結果的影響；

定向改造了pPR3-N系列載體為pPR3-GW載體，可以輕松實現核蛋白文庫到膜蛋白文庫的一步LR反應，獲得膜蛋白酵母雙雜交文庫。

文庫構建策略比較

案例展示

文庫構建質控結果：

從質控的結果上看，文庫的插入片段分布在1500bp左右，陽性率為100%

高效的一步文庫篩選結果：

從文庫篩選質控結果上看，篩選到的陽性克隆片段大小不一，插入片段分布在800~1500bp。

常見Q&A

1．Q: 酵母雙雜交的篩選流程？

A: 將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY質粒，對質粒中的cDNA片段進行測序，并對該片段的編碼序列在GENEBANK中進行比較，研究與已知基因在生物學功能上的聯系。

2. Q: 酵母雜交技術有哪些優勢？

A: a．體內的互作驗證，省去蛋白表達、純化等步驟；b. 細胞內驗證，在一定程度上反應細胞內的真實情況；c. 可以檢測微弱的蛋白互作；d. 可對不同組織、器官、細胞、分化階段材料進行文庫構建和篩選

3．Q:如何確定是選擇構建核體系文庫還是膜體系文庫？

A: 如果誘餌基因是定位在膜上的蛋白則選擇膜體系文庫，如果誘餌基因是定位于核則選擇核體系文庫，如果誘餌基因有跨膜區也可以考慮把跨膜區切除以后用核體系文庫篩庫，但是這樣操作有一定風險。

4．Q: 如果誘餌蛋白能夠直接激活報告基因的表達，改如何處理？

A: 該蛋白很可能是轉錄因子，具有轉錄激活域。可以通過基因重組切掉轉錄激活域，然后重新檢測其是否自激活。但是要注意重組也有可能破壞蛋白之間的互作。

5．Q: 雜交效率不高，怎么辦？

A: 在雜交中，預轉化的誘餌細胞的數量可能不夠。當對誘餌菌株進行液體培養過夜時，應挑選大的、新鮮的克隆進行培養，經過離心和重懸后，再使用血球計對細胞進行計數，提高雜交效率。

6．Q: 酵母雙雜交出現假陽性的原因？如何解決？

A: 由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用，或者其激活作用被外來蛋白激活。AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結合，則也可單獨激活報告基因的表達。因此，需要作嚴格的對照試驗，對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定，以排除假陽性。也可以采用多個報告基因，且每個報告基因的上游調控區各不相同，這可減少大量的假陽性。另外，報告基因整合到染色體上，可以使基因表達水平穩定，消除了由于質粒拷貝數變化引起基因表達水平波動而造成的假陽性。

7．Q: 酵母雙雜交系統有哪些應用？

A: a．發現新的蛋白質和蛋白質的新功能；b. 在細胞體內研究抗原和抗體的相互作用；c. 篩選藥物的作用位點；d. 建立基因組蛋白連鎖圖

8. Q: 金開瑞酵母雙雜交有哪些優勢？

A: a．我們會進行自激活及毒性檢測；b. 文庫構建，我們采用純化分離mRNA材料建庫，增加了文庫樣本的有效性，5’端引物設計保證N端序列的有效性；c. 文庫容量達標（>1*107cfu/mL）

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