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知無(wú)不“研”| PCR超全實(shí)驗(yàn)操作視頻及實(shí)例protocol（視頻+直播，實(shí)驗(yàn)從入門(mén)到精通)

信息來(lái)源：金開(kāi)瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2020-07-24 09:13:17

近日，2019 年全國(guó)青少年科技創(chuàng)新大賽的一項(xiàng)獲獎(jiǎng)作品引發(fā)人們關(guān)注。這位獲獎(jiǎng)同學(xué)在實(shí)驗(yàn)記錄中寫(xiě)到：2018.1.13 了解PCR技術(shù)的原理，知道PCR引物的設(shè)計(jì)......

（圖片來(lái)源于https://www.sohu.com/a/407591540_600553?_trans_=000014_bdss_dklzxbpcgP3p:CP=）

那究竟什么是PCR？PCR的實(shí)驗(yàn)原理是什么？PCR實(shí)驗(yàn)怎么做？莫慌！請(qǐng)聽(tīng)小編一一為大家解答~

PCR簡(jiǎn)介

PCR (Polymerase Chain Reaction)，中文翻譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、遺傳工程、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、人類(lèi)學(xué)等領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)流程舉例說(shuō)明

01 擴(kuò)增樣本數(shù)據(jù)分析

02 PCR擴(kuò)增需準(zhǔn)備的試劑

03 PCR擴(kuò)增需準(zhǔn)備的儀器

PCR儀

04 PCR擴(kuò)增需要的程序

擴(kuò)增樣品主要有兩個(gè)參數(shù)需要注意，一個(gè)是退火溫度，一個(gè)是延伸時(shí)間，退火溫度是根據(jù)GC含量決定的，通過(guò)軟件分析，它的GC含量屬于正常水平，所以我們?cè)O(shè)置56°。延伸時(shí)間是由擴(kuò)增基因片段長(zhǎng)度決定的，我們所使用的擴(kuò)增酶pfu酶理論上每分鐘可以擴(kuò)增2000bp，擴(kuò)增的樣品大小大概660bp左右，所以設(shè)置30s應(yīng)該是足夠了。

05 PCR反應(yīng)后，點(diǎn)膠檢測(cè)其大小，待回收大小正確的目的片段

06 結(jié)果展示與分析

07 常見(jiàn)問(wèn)題與解答

1、Q: 不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶？

A: 在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病。例如，模板中含有雜蛋白質(zhì)，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦不宜隨意更改。

2、Q: 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，但其條帶更整齊，亮度更高（假陽(yáng)性）？

A: 出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因有：①引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。因此，需重新設(shè)計(jì)引物。②靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及槍頭等均應(yīng)一次性使用。

3、Q: 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶？

A: 非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。三是酶的質(zhì)和量，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

4、Q: 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶？

A: 其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度，適當(dāng)降低Mg2+濃度。③增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

完結(jié)撒花