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知無不“研”|一文讀懂酵母單/雙雜交點對點驗證

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2020-08-10 10:16:28

一、前言

酵母雙雜交由Fields和Song在1989年提出. 他的產生是基于對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄因子GAL4性質的研究。酵母雙雜交就是基因轉錄所需的轉錄因子的兩個結構域在兩個互作蛋白的吸引下位置靠近，誘導了基因的表達。

酵母雙雜交系統的最主要的應用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用，及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統檢測蛋白之間的相互作用具有以下優點：

⑴ 作用信號是在融合基因表達后，在細胞內重建轉錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質的繁瑣步驟。

⑵ 檢測在活細胞內進行，可以在一定程度上代表細胞內的真實情況。

⑶ 檢測的結果可以是基因表達產物的積累效應，因而可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用。

⑷ 酵母雙雜交系統可采用不同組織、器官、細胞類型和分化時期材料構建cDNA文庫，能分析細胞漿、細胞核及膜結合蛋白等多種不同亞細胞部位及功能的蛋白。

二、酵母單/雙雜交簡介

1、酵母單雜交

酵母單雜交技術是在酵母雙雜基礎上發展而來的一種研究核酸-蛋白相互作用的工具，被廣泛用于研究真核細胞內基因的表達調控，如鑒別DNA結合位點發現潛在的結合蛋白基因、分析DNA結合結構域信息等。

2、酵母雙雜交

酵母雙雜交及系統是一種鑒定和檢測蛋白質相互作用的研究方法，因其具有靈敏性高、功能強大、適用范圍廣等特點，現已被應用于多個研究領域。

①核蛋白酵母雙雜交：

核蛋白酵母雙雜交技術最初由Fields等人在研究酵母轉錄因子GAL4性質時建立，后續經過不斷改進已發展成為一種成熟的蛋白-蛋白互作研究工具，具有簡便、靈敏、可反映蛋白在活細胞內互作真實情況的特點，被廣泛應用于互作蛋白的篩選、蛋白相互作用的鑒定/驗證、蛋白互作機理的探究、蛋白連鎖圖譜繪制等工作。

②膜蛋白酵母雙雜交：

DUALmembrane技術在傳統的酵母雙雜交系統的基礎上，巧妙地利用分離的泛素系統（split-ubiquitin）進行蛋白質相互作用的篩選；泛素作為降解信號分子，人為分成兩部分：N端（Nub），C端（Cub），互補重構的完整泛素分子可被泛素專一性蛋白酶（UBPs）識別，從而導致與泛素相連的蛋白被酶解。

三、核酵母單/雙雜交點對點驗證流程簡介及圖片分析

A為誘餌，B為獵物。

篩選涉及到的報告基因：

（1）HIS3。

（2）ADE2。

（3）MEL1。

誘餌質粒PGBKT7攜帶trp基因, ，獵物質粒PGADT7攜帶Leu基因。

篩選涉及到的平板：DDO[SD/-Leu/-Trp]，DDO/X[SD/-Leu/-Trp/X-α-gal]，TDO /X [SD/-Leu/-Trp/HIS3/X-α-gal]，QDO /X[SD/-Leu/-Trp/HIS3/Ade2/X-α-gal]

1、誘餌自激活驗證

分析：誘餌質粒重組質粒PGBKT7-A和獵物空載PGADT7共轉化Y2Hgold酵母菌株。（1）涂布DDO平板能夠生長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7已成功轉入宿主菌中且對宿主菌無毒性；（2）涂布TDO平板，不能生長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7無自激活現象，不能激活宿主菌報告基因his的表達；（3）涂布QDO平板沒長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7無自激活現象，沒有激活報告基因ADE2。

2、共轉驗證——陰陽性對照

3、共轉驗證——實驗組

分析：誘餌重組質粒PGBKT7-A和獵物重組PGADT7-B共轉化Y2Hgold酵母菌株。（1）涂布DDO平板能夠生長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7-B已成功轉入宿主菌中且對宿主菌無毒性；（2）涂布TDO平板能生長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7-B能夠互作，激活了宿主菌報告基因HIS3的表達；（3）涂布QDO平板能長，說明誘餌PGBKT7-A+ PGADT7-B能夠互作，同時激活了報告基因HIS3和ADE2的表達。

4、雙雜點種圖

1自激活: Y2H[PGBKT7-A+ PGADT7]

2實驗組: Y2H[PGBKT7-A+ PGADT7-B]

3陽性對照: Y2H[pGBKT7-53+pGADT7-T]

4陰性對照: Y2H[pGBKT7-lam+pGADT7-T]

5、酵母單雜點對點驗證示意圖

P為誘餌啟動子，B為獵物。

單雜篩選報告和抗性基因：

AbAr/ AUR-C，AUR1基因的一個顯性突變版本，編碼肌醇磷酸化神經酰胺syn- thase酶。AUR1-C在Y2HGold/ Y1HGold酵母株中表達，是由于蛋白質與蛋白質的相互作用，使GAL4轉錄激活和DNA結合域接近。可以添加ABA進行背景抑制。,

誘餌質粒PABAI攜帶Ura基因，獵物質粒PGADT7攜帶Leu基因。

篩選所用到的平板：SD/- Leu，SD/- Leu/+AbA

自激活結果分析：PGADT7空載轉化含誘餌啟動子PAbAi-PY1Hgold酵母菌株。

（1）涂布SD/-Leu平板能夠生長，說明誘餌PAbAi-P已成功轉入宿主菌中且對宿主菌無毒性；

（2）涂布SD/-Leu/AbA(100ng/ml)， SD/-Leu/AbA(200ng/ml) 平板能生長，說明200ng/ml的AbA不能抑制報告基因AbAr/ AUR-C ；

（3）涂布SD/-Leu/AbA(500ng/ml) ，SD/-Leu/AbA(800ng/ml)，SD/-Leu/AbA(1000ng/ml)平板沒長，說明能夠抑制報告基因AUR1-C的最低AbA濃度為500ng/ml，后續可用AbA(500ng/ml)進行共轉驗證。如果AbA最高抑制濃度1000ng/ml仍然能夠生長，則只能考慮截短誘餌啟動子。

6、共轉驗證——陰陽性對照

7、共轉驗證——實驗組

分析：誘餌啟動子重組質粒PAbAi-P轉化Y1Hgold酵母菌株涂布SD/-Ura平板，挑取單克隆菌制備成感受態，將獵物重組質粒PGADT7-B轉化到Y1Hgold【 PAbAi-P 】中。（1）涂布SD/- Leu平板能夠生長，說明獵物重組質粒PGADT7-B已成功轉入宿主菌中且對宿主菌無毒性；（2）涂布SD/- Leu /+AbA (500ng/ml)平板能生長，說明誘餌PAbAi-P + PGADT7-B能夠互作，激活了宿主菌報告基因AbAr/ AUR-C的表達。

8、單雜稀釋點種圖

更多參考案例：

1、Construction and characterization of a high-quality cDNA library of Cymbidium faberi suitable for yeast one- and twohybrid assays.

2、SlAREB1 transcriptional activation of NOR is involved in abscisic acid-modulated ethylene biosynthesis during tomato fruit ripening.

四、金開瑞核蛋白酵母雜交點對點驗證簡介

五、酵母單/雙雜點對點技術優勢：

1. 轉化效率高，較少假陰性；

2. 設置嚴格的對照實驗，排除假陽性和假陰性；

3. 酵母雙雜系統采用多個報告基因，且每個報告基因上游調控區各不相同，可大幅度減少假陽性；

4. 報告基因整合到染色體上，使基因表達水平穩定，消除了由于質粒拷貝數變化引起基因表達水平波動而造成的假陽性；

5. 嚴格設置點種驗證實驗菌體生長狀態，進一步驗證是否互作及互作強弱；

6. 嚴格保存原始實驗數據便于溯源。

六、限時五折

七、常見Q&A

1、哪些網站可以預測蛋白間互作，能把網址分享下嗎？

答：http://domine.utdallas.edu/cgi-bin/Domine

https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=ksdvF3MraTE8&input_page_active_form=single_sequence

2、關于膜蛋白的篩選，如何能提高效率和保證準確度，降低假陽性率？

答：膜蛋白的篩選是采用共轉化的方式進行的，篩選的假陽性率相對核蛋白的mating方式篩選假陽性率要低一些，但是共轉化篩選對轉化效率有要求，不然會產生假陰性。如果采用化學轉化對感受態轉化效率有一定的要求，至少達到10的4次方，感受態細胞的溶氧的提到（裝液量不超過1/5）對感受態的效率提高有幫助。電轉化感受態保存10%的甘油，轉化參數800v,15m轉化效率可以到10的5次方到6次方

3、酵母雙雜交過程需要注意的問題與細節？

答：篩選環節控制染菌可以用kan控制細菌染菌；共轉化想辦法提高轉化效率；自激活篩選壓力設置梯度盡量跨度減少，保證篩選陽性率的同時避免假陰性的產生。

4、膜蛋白篩選，構建文庫復雜嗎？

答：膜蛋白和核蛋白文庫構建再流程上多了均一化推薦處理，其他的流程基本一樣。

5、在用pGADT7和pGBKT7共轉驗證點對點互作時，AH109和Y2HGold菌株可以通用嗎？

答：可以通用

6、膜系統功能驗證是怎么做？

答：NMY51(PBT3-N-bait+post1-NubaI)此為功能驗證組，NubaI為野生型的ubiquitin的N端結構，保留了原始的三個I氨基酸結構，可以在不需要兩個蛋白產生相互作用的情況下兩個C端和N端的ubiquitin結構域結合在一起產生具有功能的ubiquitin，從而激活下游的報告基因。結論：在二缺平板上正常生長，說明共轉化成功，在三缺和四缺平板上能正常生長，說明我們的bait構建的讀碼框正確（也就是我們構建的誘餌擴譜結構可以滿足篩選的需要）。并我們的ubiquitin系統是存在功能的。

7、請問一下，如何選擇酵母雙雜交的篩選方法共轉法和mating法？

答：共轉法篩選假陽性率，但是對轉化效率有要求。轉化效率太低可能會產生假陰性；mating篩選效率高一些，但是相應的假陽性率相對高些。

8、利用去除激活域的轉錄因子X作為誘餌，篩選到互作蛋白Y。再利用X的全長蛋白導入AD載體，Y導入BD載體，共轉AH109的結果顯示不互作。怎么解析？

答：這個問題可以從兩個方便分析：1.確保第一次共轉化驗證是否是陽性，用Y2H菌株替換AH109試試，AH109菌株相對更容易產生假陽性；2.確保初次驗證是陽性結果，第二次驗證是陰性結果，猜測可能是融合的相應的BD和AD的結構域蛋白包裹了誘餌或者獵物蛋白結構域，因為酵母表達系統是真核系統，表達的蛋白是具有結構的非線性的構象，如果蛋白分子量不大，可以采用誘餌和獵物蛋白兩次串聯方式的構建，或者某個重要結構域重復串聯。

9、請給個預測靶蛋白的網站嗎，植物的？

答：https://www.uniprot.org/blast/

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