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信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2020-08-10 09:16:55
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2020年8月11日20:00
金開瑞第三期直播LIVE等你來！
和往期一樣，在直播開始之前，先來了解一下我們本場“直播新秀EMSA”。
EMSA技術簡介
凝膠遷移或電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一種檢測蛋白質和DNA相互結合的技術，主要研究DNA結合蛋白與其相關的DNA相互作用。
實驗原理
基于蛋白-探針復合物在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。當DNA探針與目的蛋白混合孵育時，目的蛋白可以與末端標記的DNA探針結合，形成DNA探針-蛋白復合物，電泳時由于這種復合物比無蛋白結合的探針分子量更大，所以在凝膠中遷移的速度慢，即表現為相對滯后。
DNA探針-目的蛋白復合物如果在膜上形成一條滯后條帶，說明目的蛋白與DNA探針發生互作，反之則不結合。
a) 實驗設計說明
根據研究目的合理設計特異性探針，還可根據需求設計突變探針或競爭性探針實驗。
b) 樣本制備
可以選擇提取樣本的總蛋白、核蛋白或者使用純化好的目的蛋白：總蛋白/核蛋白一般涉及超遷移，需要提供目的蛋白IP級別抗體；純化好的蛋白則涉及重組表達，需要考慮目的蛋白重組表達難度。
c) 探針制備
根據實驗設計合成5’端生物素標記的引物，退火后形成生物素標記的雙鏈DNA探針。
注意事項
a) 重組蛋白：
蛋白盡量上清表達，且蛋白純度需>80%
b) 核蛋白樣品的制備：
注意用專用的核蛋白抽提試劑來做，才能使制備的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和構像；掌握好核蛋白的濃度和純度，尤其是濃度；蛋白來源建議選擇細胞（便于核蛋白提取）。
c) 探針的制備：
建議合成生物素標記的引物直接進行退火；如果先合成探針再標記，可能會影響標記效率。
d) 探針長度選擇：
目的DNA的長度應小于300bp，太長會產生過多結合位點導致結果分析困難，還會產生超級螺旋結構而掩蓋結合部位。建議選用短的寡核苷酸片段（60bp以內），這樣可以確定具體的結合位點。
EMSA技術案例分析
a) 驗證性EMSA（設計多個探針，確定結合位點）
The EMSA results of binding of AlgR to the rsmX/Y/Z promoter sequence.
From：The Pseudomonas transcriptional regulator AlgR controls LipA expression via the noncoding RNA RsmZ in Pseudomonas protegens Pf-5.
小結：EMSA設置陰性對照和陽性對照；同時驗證AlgR蛋白與rsmX/Y/Z三段啟動子區域結合情況，發現只有rsmZ+AlgR有滯后條帶。
說明：AlgR蛋白可以與rsmZ啟動子區域結合。
b) 驗證性EMSA（設計WT和MUT探針）
From：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.
小結：在明確結合位點的情況下設計野生型和突變型DNA探針，EMSA電泳時野生型DNA探針和純化蛋白結合的復合物比無蛋白結合的DNA探針在凝膠中泳動的速度慢，顯色后出現滯后條帶；而突變型DNA探針則無滯后條帶。
說明：SIHZ24蛋白可以與SIGMP3啟動子結合。
c) 競爭性EMSA（設計標記和未標記探針）
From：Manipulation of Light Signal Transduction Factors as a Means of Modifying Steroidal Glycoalkaloids Accumulation in Tomato Leaves.
與探針序列相同，不標記修飾基團的DNA片段稱為冷探針（競爭探針）。
作用：冷探針含有和探針相同的DNA序列，會干擾探針與蛋白的結合。在電泳圖的相應位置處，電泳帶的的信號減弱或消失。
優點：探針和蛋白的結合未必是特異性結合，或者蛋白本身可能含有生物素，二者均能產生假陽性的實驗結果。增加一個冷探針的干擾實驗，可以排除假陽性結果，增加實驗結果的準確性。
d) 超遷移EMSA（需要IP級別抗體）
From：Transcriptional regulation of microRNA-126a by farnesoid X receptor in vitro and in vivo.
小結：提取核蛋白后EMSA檢測蛋白FXR與miR-216a啟動子結合情況，由于核蛋白是混合蛋白，所以需要確定目的蛋白FXR則需要加入Anti-FXR進一步確認，發現DNA-蛋白滯后條帶上方出現DNA-蛋白-抗體更滯后的條帶（即超遷移）。
說明：核蛋白中與miR-216a啟動子結合的蛋白是FXR。
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