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【客戶文章分享】IF=10.317，Label-free揭秘脫細(xì)胞處理能優(yōu)化視神經(jīng)的抑制性微環(huán)境從而促進(jìn)神經(jīng)突生長

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2020-10-26 09:16:59

本期解讀

題目：Decellularizationoptimizes the inhibitory microenvironment of the optic nerve tosupport neurite growth

期刊：Biomaterials

影響因子：10.317

合作技術(shù)：label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)

研究背景

細(xì)胞外空間中神經(jīng)元的多種元素組合構(gòu)成了神經(jīng)組織的微環(huán)境，在神經(jīng)損傷修復(fù)中起關(guān)鍵作用。先前已有眾多研究，嘗試通過改變微環(huán)境中“促進(jìn)劑”和“抑制劑”的平衡的方式，以增強(qiáng)損傷后的神經(jīng)再生。因此，探索調(diào)控?fù)p傷后神經(jīng)組織微環(huán)境中促進(jìn)劑和抑制劑平衡的方法具有重要的科學(xué)意義。特殊的大腦神經(jīng)視神經(jīng)（ON）的視覺通路具有中樞神經(jīng)微環(huán)境。

先前的研究顯示，ON難以在體內(nèi)和體外支持軸突再生，研究集中于不同脫細(xì)胞組織支架的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)效應(yīng)。脫細(xì)胞處理的坐骨神經(jīng)（DSN）、脊髓（DSC）和腦細(xì)胞已被用于修復(fù)不同的神經(jīng)組織損傷。由于脫細(xì)胞技術(shù)是去除包括大多數(shù)免疫原和可溶性蛋白的細(xì)胞成分的有效方法，因此我們認(rèn)為脫細(xì)胞作用也可以去除ON中的某些抑制性成分，同時(shí)保留了一些不溶的促進(jìn)軸突生長的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白。

在這項(xiàng)研究中，作者使用大鼠背根神經(jīng)節(jié)（DRG）培養(yǎng)模型制備了成熟豬的脫細(xì)胞性視神經(jīng)（DON），DSN和DSC，并評(píng)估了它們對(duì)神經(jīng)突生長的影響，比較了脫細(xì)胞前后ON的蛋白質(zhì)成分，發(fā)現(xiàn)DON優(yōu)化的神經(jīng)突促進(jìn)作用與其蛋白質(zhì)組成的變化高度相關(guān)。證明脫細(xì)胞處理后，膠原蛋白IV（COL4）和層粘連蛋白（LAM）的生物活性在DON中能很好的保留。結(jié)果表明，脫細(xì)胞后促進(jìn)神經(jīng)突生長的ECM蛋白的選擇性保留優(yōu)化了ON的抑制性微環(huán)境。

技術(shù)路線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1、DON，DSN和DSC中殘留DNA的表征

同種異體移植物中的核殘基可能在宿主內(nèi)引起一系列免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用和受損的組織修復(fù)。因此，評(píng)估脫細(xì)胞作用的最重要任務(wù)是定量脫細(xì)胞材料中的核殘基。

顯微鏡檢查組織切片顯示天然組織（NT）的無孔結(jié)構(gòu)和脫細(xì)胞組織（DT）的多孔結(jié)構(gòu)（圖1A和B），脫細(xì)胞處理后組織切片中沒有核染色（圖1B）。在所有DT中，DNA含量均小于50ng / mg（圖1C）。在任何DT的凝膠電泳過程中均未觀察到DNA信號(hào)（圖1D）。這些結(jié)果表明細(xì)胞成分已被有效地從DT中去除。

圖1 分析DT中的核酸殘基

2、ON的脫細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)突向外生長

為了評(píng)估DT對(duì)神經(jīng)突生長的影響，在縱向組織切片上進(jìn)行了離體背根神經(jīng)節(jié)（DRG）實(shí)驗(yàn)。生長72小時(shí)后，將細(xì)胞和組織固定，并對(duì)神經(jīng)突進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記；然后在熒光顯微鏡下確定神經(jīng)突的最大延伸距離和分支數(shù)（圖2A和B）。圖2C顯示了支路的最大延伸距離和數(shù)目如何被定義。從結(jié)果來看，在DON和DSC上生長的神經(jīng)突明顯顯示出更長的延伸距離。結(jié)果表明，脫細(xì)胞作用可以促進(jìn)DRG神經(jīng)突在包括ON和SC在內(nèi)的中樞神經(jīng)組織上的生長。雖然原始的ON切片不是神經(jīng)突生長的理想基質(zhì)，但一些神經(jīng)突(圖2D中的白色箭頭)仍然能夠沿著神經(jīng)纖維束區(qū)域(圖2D中的白色星號(hào))之間的結(jié)締組織隔生長。這表明與神經(jīng)纖維束區(qū)域相比，ON的結(jié)締組織隔可能含有支持神經(jīng)突延伸的某些成分，或缺少某些抑制神經(jīng)突生長的成分。

圖2 不同組織基質(zhì)對(duì)DRG神經(jīng)突生長的影響

3、DON對(duì)神經(jīng)突取向和神經(jīng)元附著的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證DON在神經(jīng)突延伸方向中的作用，我們?cè)贒T（DON，DSN和DSC）和NT（ON，SN和SC）的切片上植入了分離的DRG神經(jīng)元。孵育72小時(shí)后，我們觀察到，與NT切片（圖3A1-3，箭頭）相比，DT切片（圖3A1'-3'，箭頭）附著了更多的DRG神經(jīng)元。我們通過測量NF陽性神經(jīng)突與組織切片縱軸之間的角度來量化生長取向（圖3B）。DON切片上偏離角度為0°–30°的神經(jīng)突所占比例大于DSN切片和DSC切片（圖3C）。這表明與其他DTs相比，DON對(duì)神經(jīng)突生長具有更強(qiáng)的定向作用。此外，我們通過計(jì)算神經(jīng)元密度來評(píng)估不同組織切片上的細(xì)胞粘附性，神經(jīng)元密度是在0.5mm×0.5 mm區(qū)域內(nèi)被NF和Hoe雙重標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量（圖3D）。DON和DSC組的神經(jīng)元密度顯著高于ON和SC組（圖3E）。DSN和SN組之間的NF陽性細(xì)胞數(shù)量上沒有顯著差異（圖3E）。

圖3 DRG神經(jīng)元的存活和神經(jīng)突生長

4、ON的脫細(xì)胞主要保留促進(jìn)神經(jīng)突生長蛋白

與NT相比，DT上神經(jīng)突的不同生長行為可能是由于脫細(xì)胞過程引起的蛋白質(zhì)組成變化所致。因此，對(duì)所有三種DT進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并比較了DON，成熟視神經(jīng)（MON）和胚胎視神經(jīng)（EON）組中每組所有三個(gè)重復(fù)序列中檢測到的蛋白質(zhì)成分的變化。從DON，DSN和DSC組中篩選了ECM蛋白，并使用維恩圖（圖4A）可視化了它們的設(shè)置關(guān)系。脫細(xì)胞后，ON丟失了1161個(gè)蛋白質(zhì)（圖4B），其中僅丟失了9種ECM蛋白（圖4B）。這表明ECM蛋白在脫細(xì)胞過程中被選擇性保留，而細(xì)胞內(nèi)蛋白被去除。斑點(diǎn)印跡檢測兩種普遍存在的ECM成分（COL4和LAM）進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果。與MON相比，發(fā)現(xiàn)DON和EON中COL4和LAM的濃度均增加（圖4C）。如圖4D所示，脫細(xì)胞后觀察到不同ECM蛋白的上調(diào)和下調(diào)。在標(biāo)記每個(gè)ECM蛋白及其與軸突生長相關(guān)的生物學(xué)功能后，我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(8分之7)生長促進(jìn)蛋白與軸突延長相關(guān)。COL4和LAMB1在ON細(xì)胞脫細(xì)胞后被保存并富集。相反，大多數(shù)(7分之5)的抑制軸突延伸蛋白在脫細(xì)胞后水平較低(圖4E)。

圖4 不同DTs的蛋白質(zhì)組學(xué)分析以及ON和DON組織結(jié)果的比較

5、DON中的COL4和LAM保留生物活性以支持神經(jīng)突生長

為了驗(yàn)證脫細(xì)胞后保留的基質(zhì)蛋白的功能活性，我們選擇COL4和LAM作為測試蛋白，因?yàn)樗鼈冊(cè)诖龠M(jìn)神經(jīng)再生方面具有已知的活性。圖5A顯示了對(duì)照組中DON切片上DRG神經(jīng)突生長的狀態(tài)。具有不同半徑的紅色虛線表示用于確定交叉點(diǎn)的定量方法（圖5C）。使用了針對(duì)COL4或LAM的抗體來阻斷DON中這些蛋白質(zhì)的功能。隨著抗體濃度的增加，DON中的神經(jīng)突在長度和密度上降低，COL4或LAM重新引入培養(yǎng)環(huán)境可恢復(fù)DON中DRG的神經(jīng)突生長活性（圖5B-D）。這些結(jié)果表明，DON中保留的COL4和LAM都在支持神經(jīng)突生長中發(fā)揮作用，且LAM比COL4更能支持神經(jīng)突生長。

圖5 COL4和LAM支持DON中神經(jīng)突的生長

6、DON中保留的COL4和LAM可以與ITGA1結(jié)合

由于脫細(xì)胞涉及物理性震蕩，化學(xué)溶解和酶促分解，可能會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此尚不清楚DON中保留的ECM蛋白是否可以通過結(jié)合其蛋白伴侶發(fā)揮功能。整合蛋白在神經(jīng)元細(xì)胞膜上的分布和激活已被證明在成功的軸突再生中發(fā)揮重要作用，而COL4/LAM與ITGA1的相互作用被認(rèn)為可以促進(jìn)交感神經(jīng)元的軸突生長。免疫染色顯示，COL4和LAM在DON中明確表達(dá)(圖6A)。在將DRG接種三天后，我們觀察到DON切片中神經(jīng)突沿ITGA1的點(diǎn)狀表達(dá)（圖6B）。這些結(jié)果證實(shí)了ITGA1在介導(dǎo)DRG神經(jīng)突生長中的重要作用。隨后，我們以ITGA1為誘餌，利用Co-IP技術(shù)研究了DON-DRG培養(yǎng)體系中ITGA1與其ECM蛋白(COL4和LAM)的相互作用(圖6C)。我們的結(jié)果顯示COL4和LAM都與ITGA1相互作用，如圖6D所示。

圖6 DON-DRG培養(yǎng)系統(tǒng)中COL4或LAM與ITGA1的相互作用

小結(jié)

在本研究中，發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞作用可以優(yōu)化成熟視神經(jīng)在支持背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)突定向生長方面的功能。在DON上生長的神經(jīng)突比在ON上生長的神經(jīng)突具有更長的延伸距離。與ON相比，DON上的神經(jīng)突分支也顯著增加。脫細(xì)胞作用能選擇性去除了一些軸突抑制分子，例如髓鞘相關(guān)糖蛋白和硫酸軟骨素蛋白聚糖，并保留了一些軸突促進(jìn)的ECM蛋白，包括COL4和LAM。此外，顯示COL4和LAM在DON中被保留，并且它們與整合蛋白ITGA1的結(jié)合活性被保留以促進(jìn)DRG神經(jīng)突的延伸。總之，這些發(fā)現(xiàn)為優(yōu)化中樞神經(jīng)組織軸突抑制微環(huán)境提供了可行途徑，并為DON支架在中樞神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

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