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超詳細！手把手教你做RNA pull down

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2020-12-03 15:16:34

在之前的文章中我們已經了解了RNA pull down 實驗的原理、應用、案例和注意事項（回顧點這里），今天我們來嘮一嘮RNA pull down 實驗的詳細步驟~

RNA pull down 實驗步驟

1、構建 RNA 過表達質粒：基因合成 +測序驗證；

2、體外轉錄模板準備：設計含 T7 啟動子引物，PCR 擴增得到轉錄模板；

3、體外轉錄：以 PCR 產物為模板，體外轉錄得到目的 RNA；

4、RNA pull down ：通過磁珠 -RNA 探針復合物富集互作的蛋白；

5、銀染質檢：SDS -PAGE 電泳銀染檢測富集蛋白的情況；

6、質譜鑒定：通過質譜鑒定實驗組與對照的差異蛋白；進而篩選可能的互作蛋白。

一、構建RNA過表達質粒

1、首先通過其他手段篩選確定自己感興趣的 RNA （以下講解lncRNA 為主）；檢索數據庫找到對應的 RNA 堿基序列；

2、再通過 RACE 擴增是否存在未知序列，由于 lncRNA-RACE 成功率非常低，嘗試擴增后再確定 RNA pull down 使用的序列；

3、確認 RNA pull down 使用的序列后，設計引物全基因合成目RNA 序列，構建到 pcDNA3.1（載體可以根據其他實驗靈活替換）過表達中，并測序驗證序列準確性；

4、最后提取過表達質粒備用。

二、體外轉錄模板準備

實驗分組：

實驗組：sense 鏈即目的 RNA 序列

對照組：antisense 鏈即目的 RNA 互補序列

引物設計方法：

在正向引物前面加入 T7 啟動子序列；反向引物不變。

以構建過表達質粒為模板 +設計合成好的引物，擴增得到體外轉錄模板，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增 PCR 產物情況，切取目的條帶純化回收備用。

三、體外轉錄

1、以純化回收的 PCR 產物作為轉錄模板，用體外轉錄試劑盒進行轉錄得到目的 RNA （含 sense 及antisense 兩組）；

2、不同試劑盒轉錄情況（轉錄RNA 大小、轉錄 RNA 量等等）會有所不同。

四、RNA pull down

1、蛋白液提前準備：

優先選擇細胞系：pull -down 實驗前需要提供對應的細胞系，擴大培養后收集細胞裂解提取總蛋白備用；

組織樣品作為備選：動物或者植物組織液氮研磨后超聲裂解提取總蛋白備用。由于組織樣品需要前處理，且其中包含很多雜質可能會對磁珠富集產生影響，最終影響富集效率導致富集蛋白量較少，進而影響最終鑒定結果。

2、以上體外轉錄得到的 RNA ，標記生物素后純化備用；

3、標記生物素 RNA 探針與鏈霉親和素磁珠共孵育形成復合物；

4、生物素 RNA 探針 -鏈霉親和素磁珠復合物富集蛋白；

5、富集蛋白洗脫保存。

五、銀染

電泳→固定→致敏→染色→顯色→終止

六、質譜鑒定

RNA pull down 富集蛋白質譜通常選擇膠條鑒定。

根據銀染結果來選擇質譜鑒定的方式：

A、存在肉眼可見差異條帶：

切取 sense 實驗組泳道中的差異條帶進行膠鑒定。當差異條帶非常多時，節約質譜費用也可以選擇 sense 和 antisense 兩組蛋白液分別進行質譜。

B、無肉眼可見差異條帶：

將sense 實驗組和 antisense 對照組兩蛋白液分別進行全譜鑒定，根據鑒定分析結果找出 sense 實驗組中特有的蛋白，進而篩選與自己研究相關的蛋白進行后續驗證。

C、存在濃度差異條帶：

也將 sense 實驗組和 antisense 對照組兩蛋白液分別進行全譜鑒定，根據鑒定分析結果找出 sense 實驗組中特有的蛋白，進而篩選與自己研究相關的蛋白進行后續驗證。

七、驗證實驗

根據 RNA pull -down 質譜鑒定分析結果，篩選與自己研究相關的可能互作蛋白。

購買對應蛋白 IP 級別抗體；或者構建標簽重組過表達質粒 /慢病毒處理細胞。使用目的蛋白抗體或者標簽進行 RIP -QPCR實驗反向驗證。

八、直播預告

12月1日（周二）20:00

直播教你做RNA pull down

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