客戶文獻| 基因組和蛋白質組學技術揭示TrxR對芽孢桿菌Y3的亞硒酸鹽和亞硒酸鹽的還原及抗性的必要性
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2021-03-09 10:48:01
文章亮點
基因組與蛋白組聯合分析挖掘關鍵蛋白基因、iTRAQ定量分析與qPCR共同驗證蛋白表達差異、關鍵蛋白外源表達及功能驗證。
NAD（P）H依賴的硫氧還蛋白-二硫化物還原酶TrxR對于芽孢桿菌Y3對亞碲酸鹽和亞硒酸鹽的還原以及抗逆性是必不可少的
題目：NAD(P)H dependent thioredoxin-disulfide reductase TrxR is essential for tellurite and selenite reduction and resistance in Bacillus sp. Y3
期刊：FEMS MICROBIOLOGY ECOLOGY
影響因子：3.675
合作技術：iTRAQ定量蛋白組學
一、研究背景
Se(IV)和Te(IV)離子的毒性明顯強于以固體納米粒子形式存在的Se(0)和Te(0)，因此利用潛在的微生物還原作用，將環境中的Se(IV)和Te(IV)轉化為Se(0)和Te(0)將會大大減輕硒碲離子對環境的污染。在本研究中，作者通過基因組測序和iTRAQ定量蛋白組學分析，在一株高耐受Se(IV)、Te(IV)離子的菌株Y3中挖掘到一個與催化Se(IV)、Te(IV)離子還原相關的潛在關鍵蛋白TrxR，并通過外源表達驗證了該蛋白的功能。
二、技術路線
菌株分離鑒定--菌株對硒碲離子抗性測試--基因組測序、iTRAQ蛋白組定量分析--TrxR蛋白基因表達量qPCR驗證--TrxR蛋白外源表達及功能驗證--TrxR酶活檢測
三、研究結果
1. 菌株Y3篩選與鑒定
作者利用R2A平板培養基從湖北省武漢市某養豬場的廢水中分離得到一株對Se(IV)有較強抗性和對Te(IV)有一定抗性的野生型菌株Y3，經16S rRNA測序和NCBI網站Blast比對，并基于該菌的16S rRNA序列構建菌株進化樹，鑒定該菌屬于芽孢桿菌屬Bacillus，并將其命名為Bacillus sp. Y3。該菌對Se(IV)和Te(IV)的最大耐受濃度（250 mM Se(IV)或0.7 mM Te(IV)）明顯高于目前報道的具有還原作用的菌株如Comamonas testosterone S44 (Zheng et al., 2014), Lysinibacillus xylanilyticus和 Lysinibacillus macrolides (Zhang et al., 2019a)等等。
2. 菌株Y3對Se(IV)和Te(IV)離子的還原作用
作者將菌株Bacillus sp. Y3分別培養在添加了1 mM Se(IV)或0.5 mM Te(IV)以及同時添加了Se(IV)和Te(IV)的培養基中，培養結果表明單獨添加兩種物質時，菌株的生長幾乎不受影響，且Se(IV)和Te(IV)迅速被還原，在同時添加了Se(IV)和Te(IV)的培養基中，菌株在前期生長被抑制，但是最終的菌體量和菌株對Se(IV)和Te(IV)的還原作用沒有受到明顯影響。結果表明菌株Bacillus sp. Y3能同時快速地將Se(IV)和Te(IV)還原為Se(0)和Te(0)。
3. iTRAQ定量分析與功能基因挖掘
作者通過對基因組數據進行挖掘分析發現，與催化Se(IV)和Te(IV)還原相關的基因并沒有在菌株Y3的基因組中找到，然而，通過武漢金開瑞生物工程有限公司的iTRAQ定量蛋白質組技術對在添加了Se(IV)和Te(IV)條件下培養的菌株進行分析發現，相比于對照組，實驗組中大量蛋白質的表達水平存在顯著差異，共有157個蛋白表達量顯著上調和227個蛋白表達量顯著下調，并且發現，具有還原性的谷胱甘肽過氧化物酶和II型延胡索酸酶的表達量分別上調了2.7和2.63倍。有趣的是，通過iTRAQ定量分析發現實驗組的硫氧還蛋白-二硫化物還原酶TrxR的表達量被上調了高達18.79倍，另外，通過分析對照組和實驗組之間不同的代謝途徑，發現菌株Y3的能量合成和硫酸鹽代謝途徑蛋白的表達受Se(IV)和Te(IV)的誘導，因此，作者認定TrxR蛋白在催化Se(IV)和Te(IV)還原過程中可能起到了關鍵作用。為了進一步證實TrxR蛋白表達的上調與Se(IV)和Te(IV)的被還原密切相關，作者使用qRT-PCR分析了對照組和添加了Se(IV)和Te(IV)實驗組之間細胞內TrxR蛋白基因轉錄的差異，結果表明，TrxR基因的轉錄量明顯被Se(IV)和Te(IV)上調，上調比例分別為7.8和3.6倍，而當共同添加Se(IV)和Te(IV)時，TrxR基因的轉錄量更為顯著的上調了15.3倍，與蛋白質組學結果相符。
4. TrxR蛋白功能驗證
為進一步驗證TrxR蛋白對Se(IV)和Te(IV)的還原和抗性功能，作者將該蛋白基因導入到大腸桿菌中外源表達，培養發現，經成功表達了TrxR蛋白的大腸桿菌能在添加了Se(IV)和Te(IV)的培養基中正常生長，而對照組無法在同樣的培養基中生長，并且導入TrxR蛋白基因后，大腸桿菌能將培養基中的Se(IV)和Te(IV)還原為Se(0)和Te(0)，驗證了TrxR蛋白不僅在Se(IV)和Te(IV)的還原途徑中發揮著關鍵作用，而且增強了大腸桿菌工程菌對Se(IV)和Te(IV)的耐受性。
四、小結
這篇文章對一株野生型菌株Y3進行了基因組測序分析和物種鑒定分析，并通過培養基優化發現該菌對Se(IV)和Te(IV)具有較強的耐受性并且能較快的將Se(IV)和Te(IV)還原成固體形式的Se(0)和Te(0)，從而修復Se(IV)和Te(IV)對環境的污染。通過基因組分析發現菌株Y3基因組中并沒有大多數文獻報道過的與還原Se(IV)和Te(IV)相關的蛋白基因，而通過iTRAQ定量蛋白組學分析發現與能量合成和硫酸鹽代謝途徑相關的蛋白受到Se(IV)和Te(IV)的調控，并且TrxR蛋白表達量在有Se(IV)和Te(IV)存在的條件下顯著上調，并通過外源表達驗證了TrxR蛋白確實在菌株Y3對Se(IV)和Te(IV)的還原過程中起著關鍵的作用。該文章說明了蛋白組定量能更直觀的反映出潛在的作用于關鍵代謝途徑中的蛋白表達量變化情況，蛋白質組學在挖缺關鍵功能蛋白方面具有基因組和轉錄組無可比擬的優勢。
基因組與蛋白組聯合分析挖掘關鍵蛋白基因、iTRAQ定量分析與qPCR共同驗證蛋白表達差異、關鍵蛋白外源表達及功能驗證。
NAD（P）H依賴的硫氧還蛋白-二硫化物還原酶TrxR對于芽孢桿菌Y3對亞碲酸鹽和亞硒酸鹽的還原以及抗逆性是必不可少的
題目：NAD(P)H dependent thioredoxin-disulfide reductase TrxR is essential for tellurite and selenite reduction and resistance in Bacillus sp. Y3
期刊：FEMS MICROBIOLOGY ECOLOGY
影響因子：3.675
合作技術：iTRAQ定量蛋白組學
一、研究背景
Se(IV)和Te(IV)離子的毒性明顯強于以固體納米粒子形式存在的Se(0)和Te(0)，因此利用潛在的微生物還原作用，將環境中的Se(IV)和Te(IV)轉化為Se(0)和Te(0)將會大大減輕硒碲離子對環境的污染。在本研究中，作者通過基因組測序和iTRAQ定量蛋白組學分析，在一株高耐受Se(IV)、Te(IV)離子的菌株Y3中挖掘到一個與催化Se(IV)、Te(IV)離子還原相關的潛在關鍵蛋白TrxR，并通過外源表達驗證了該蛋白的功能。
二、技術路線
菌株分離鑒定--菌株對硒碲離子抗性測試--基因組測序、iTRAQ蛋白組定量分析--TrxR蛋白基因表達量qPCR驗證--TrxR蛋白外源表達及功能驗證--TrxR酶活檢測
三、研究結果
1. 菌株Y3篩選與鑒定
作者利用R2A平板培養基從湖北省武漢市某養豬場的廢水中分離得到一株對Se(IV)有較強抗性和對Te(IV)有一定抗性的野生型菌株Y3，經16S rRNA測序和NCBI網站Blast比對，并基于該菌的16S rRNA序列構建菌株進化樹，鑒定該菌屬于芽孢桿菌屬Bacillus，并將其命名為Bacillus sp. Y3。該菌對Se(IV)和Te(IV)的最大耐受濃度（250 mM Se(IV)或0.7 mM Te(IV)）明顯高于目前報道的具有還原作用的菌株如Comamonas testosterone S44 (Zheng et al., 2014), Lysinibacillus xylanilyticus和 Lysinibacillus macrolides (Zhang et al., 2019a)等等。
2. 菌株Y3對Se(IV)和Te(IV)離子的還原作用
作者將菌株Bacillus sp. Y3分別培養在添加了1 mM Se(IV)或0.5 mM Te(IV)以及同時添加了Se(IV)和Te(IV)的培養基中，培養結果表明單獨添加兩種物質時，菌株的生長幾乎不受影響，且Se(IV)和Te(IV)迅速被還原，在同時添加了Se(IV)和Te(IV)的培養基中，菌株在前期生長被抑制，但是最終的菌體量和菌株對Se(IV)和Te(IV)的還原作用沒有受到明顯影響。結果表明菌株Bacillus sp. Y3能同時快速地將Se(IV)和Te(IV)還原為Se(0)和Te(0)。
3. iTRAQ定量分析與功能基因挖掘
作者通過對基因組數據進行挖掘分析發現，與催化Se(IV)和Te(IV)還原相關的基因并沒有在菌株Y3的基因組中找到，然而，通過武漢金開瑞生物工程有限公司的iTRAQ定量蛋白質組技術對在添加了Se(IV)和Te(IV)條件下培養的菌株進行分析發現，相比于對照組，實驗組中大量蛋白質的表達水平存在顯著差異，共有157個蛋白表達量顯著上調和227個蛋白表達量顯著下調，并且發現，具有還原性的谷胱甘肽過氧化物酶和II型延胡索酸酶的表達量分別上調了2.7和2.63倍。有趣的是，通過iTRAQ定量分析發現實驗組的硫氧還蛋白-二硫化物還原酶TrxR的表達量被上調了高達18.79倍，另外，通過分析對照組和實驗組之間不同的代謝途徑，發現菌株Y3的能量合成和硫酸鹽代謝途徑蛋白的表達受Se(IV)和Te(IV)的誘導，因此，作者認定TrxR蛋白在催化Se(IV)和Te(IV)還原過程中可能起到了關鍵作用。為了進一步證實TrxR蛋白表達的上調與Se(IV)和Te(IV)的被還原密切相關，作者使用qRT-PCR分析了對照組和添加了Se(IV)和Te(IV)實驗組之間細胞內TrxR蛋白基因轉錄的差異，結果表明，TrxR基因的轉錄量明顯被Se(IV)和Te(IV)上調，上調比例分別為7.8和3.6倍，而當共同添加Se(IV)和Te(IV)時，TrxR基因的轉錄量更為顯著的上調了15.3倍，與蛋白質組學結果相符。
4. TrxR蛋白功能驗證
為進一步驗證TrxR蛋白對Se(IV)和Te(IV)的還原和抗性功能，作者將該蛋白基因導入到大腸桿菌中外源表達，培養發現，經成功表達了TrxR蛋白的大腸桿菌能在添加了Se(IV)和Te(IV)的培養基中正常生長，而對照組無法在同樣的培養基中生長，并且導入TrxR蛋白基因后，大腸桿菌能將培養基中的Se(IV)和Te(IV)還原為Se(0)和Te(0)，驗證了TrxR蛋白不僅在Se(IV)和Te(IV)的還原途徑中發揮著關鍵作用，而且增強了大腸桿菌工程菌對Se(IV)和Te(IV)的耐受性。
四、小結
這篇文章對一株野生型菌株Y3進行了基因組測序分析和物種鑒定分析，并通過培養基優化發現該菌對Se(IV)和Te(IV)具有較強的耐受性并且能較快的將Se(IV)和Te(IV)還原成固體形式的Se(0)和Te(0)，從而修復Se(IV)和Te(IV)對環境的污染。通過基因組分析發現菌株Y3基因組中并沒有大多數文獻報道過的與還原Se(IV)和Te(IV)相關的蛋白基因，而通過iTRAQ定量蛋白組學分析發現與能量合成和硫酸鹽代謝途徑相關的蛋白受到Se(IV)和Te(IV)的調控，并且TrxR蛋白表達量在有Se(IV)和Te(IV)存在的條件下顯著上調，并通過外源表達驗證了TrxR蛋白確實在菌株Y3對Se(IV)和Te(IV)的還原過程中起著關鍵的作用。該文章說明了蛋白組定量能更直觀的反映出潛在的作用于關鍵代謝途徑中的蛋白表達量變化情況，蛋白質組學在挖缺關鍵功能蛋白方面具有基因組和轉錄組無可比擬的優勢。
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