肽是氨基酸的二維線性鏈，通常長度短（小于50 AA）。通過合理的計算方法或噬菌體展示篩選來設計它們，以獲得與目標靶標具有高特異性結合的肽，調節靶標的可能性。與抗體（約150 kDa）相比，肽相對較小（約3-5 kDa），因此易于合成和修飾，具有更高的細胞膜滲透性，免疫原性較低。在癌癥治療中，這些肽可用作靶向配體，協助將細胞毒性藥物特異性遞送至腫瘤血管，腫瘤微環境或癌細胞。另一方面，肽還可以在細胞內遞送以靶向癌癥特異性上調的轉錄因子，癌基因或酶。
如何應用噬菌體展示生物淘選技術尋找腫瘤靶向肽呢？2019年4月21日，來自廣東省惡性腫瘤表觀遺傳與基因調控重點實驗室的Er-Wei Song 研究團隊在Protein & Cell (IF=10.164) 上發表了題為“Phage display screening of therapeutic
peptide for cancer targeting and therapy”的綜述論文，討論用于通過原位，體外，體內和離體篩選方法分離各種癌癥特異性配體的噬菌體展示技術的改進。并且介紹了實體腫瘤靶向肽的突出例子，即通過噬菌體展示篩選確定的靶向腫瘤血管的肽，腫瘤微環境（TME）和癌細胞上的過度表達受體，以及在臨床中基于靶向肽治療劑的當前挑戰和未來前景。

1、噬菌體展示技術和生物淘選策略
噬菌體展示是一種用于篩選和分離靶標特異性肽的強大技術。 該方法利用噬菌體通過將編碼相應多肽的基因插入噬菌體基因組來在其表面上展示外源肽或抗體。 為了在噬菌體上展示外源多肽，將所需的DNA序列插入M13噬菌體pIII或pVIII基因中（圖1）。 使用主要外殼蛋白pVIII的方法可提供多價展示，但是只能在pVIII基因上展示短肽（6-7 AA）。因此，大多數組合文庫（例如抗體或蛋白質）都使用次要外殼pIII進行了展示。 由于每個噬菌體只能有3-5個pIII蛋白的拷貝，因此這種方法限制了拷貝數，但是可以限制表達的外源或合成多肽的長度（圖1）。

圖1、M13噬菌體的典型代表，其長度約為1,000 nm，寬度約為5 nm。
噬菌體選擇方法，稱為生物淘選，是一種分離靶標結合分子的親和力選擇過程。（圖2），通常基于噬菌體展示的生物淘選由五個篩選步驟組成。第一步是“文庫構建和擴增”，其中通過克隆組合DNA序列構建多肽展示的噬菌體文庫。該文庫將在生物淘選之前進行擴增。第二步是“靶標捕獲步驟”，其將噬菌體文庫與靶分子孵育特定時間以使其結合。第三步是通過重復洗滌“去除未結合和非特異性的噬菌體”去除任何未結合且非靶標特異性的噬菌體。第四步是“洗脫步驟”，在與低pH緩沖液短暫孵育后或通過競爭性洗脫，將目標結合的噬菌體分離出來。最后，在第五步“感染階段”中，將洗脫的噬菌體感染細菌以擴增選定的噬菌體，從而形成了一個新的，更具選擇性的噬菌體文庫，該文庫應用于下一輪生物淘選。
通常，需要三到五輪生物淘洗來分離特異性和高親和力的結合肽，除去非特異性噬菌體，并通過增加洗滌次數和減少靶分子的量來增加每輪生物淘選的嚴格性，從而分離出對靶標具有高親和力的噬菌體。 在生物淘選結束時，噬菌體ELISA和DNA測序用于鑒定對靶標具有高親和力的個別特異性噬菌體。

圖2、噬菌體展示技術的一般方案和高親和力肽的生物淘選。
2、通過噬菌體展示篩選分離高親和力肽的大量研究
盡管使用固定化抗原的原位噬菌體展示篩選能夠產生高親和力和特異性肽，為了更好地模擬細胞和身體狀況，在體外，體內進行了大量研究，離體，甚至癌癥患者）在異質環境中篩選高親和力肽，因為這更接近其原始狀況。研究方法有以下幾種：1、均質的原位篩選僅需要將特定靶標包被在96孔上（圖3A），單一靶標接觸可確保分離靶標特異性肽，而不會受到非特異性結合的外部干擾。 這種方法也是最簡單的，因為所有實驗都可以在沒有活體系統（即細胞培養，動物模型，患者樣品）的情況下進行。2、體外細胞篩選提供了高通量的方法，可用于鑒定與單個細胞（即細胞系或原代細胞）特異性結合的多種肽，并可在貼壁細胞（活的或固定的）上進行（圖3B）。3、通過在活體動物中進行生物淘選和選擇，可以分離器官特異性肽（圖3C）。4、離體篩選，在不分選細胞的情況下，在包含整個細胞群的載玻片上進行生物淘選（圖3D）。5、為了減少小鼠和人類之間物種差異的相容性，據報道已針對人類患者篩選了噬菌體展示（圖3E）。
 

圖3、通過噬菌體展示篩選來捕獲高親和力肽的各種方法。
3、腫瘤靶向肽
腫瘤靶向肽是一種功能強大的工具，可用于癌癥診斷和治療，因為它們具有較低的生產成本和可以擴大規模，易于合成的優點。 靶向配體：對靶標具有高親和力和特異性，與基于大型抗體的配體相比，具有較高的腫瘤滲透性。在實體瘤的復雜性中，肽可用于靶向功能異常的腫瘤脈管系統，致密的細胞外基質，腫瘤基質細胞或腫瘤上過表達的受體。通過噬菌體展示生物淘選技術鑒定的一些突出的多肽實例及其在生物醫學領域中的應用如下：腫瘤微環境（TME）靶向肽，腫瘤血管靶向肽，腫瘤內皮細胞（EC）靶向肽，基質金屬蛋白酶靶向肽，生成血管周細胞的靶向肽，細胞外基質（ECM）靶向肽，腫瘤相關巨噬細胞（TAM）靶向肽，癌相關成纖維細胞（CAF）靶向肽，腫瘤靶向肽開發的靶標CD10+GPR77+ CAFs和CD146等等。

圖4、特異性噬菌體與癌細胞系hCRC活檢標本的結合
4、腫瘤靶向肽上的過表達受體
在癌癥治療中，過表達的受體受到靶向劑的調節，例如抗體，抗體片段，肽或小的化學物質，它們可以通過直接結合這些受體來阻斷其活性，從而終止下游機制，阻斷了癌癥的進展。利用受體過表達來靶向遞送抗癌藥物或生物活性分子是無法區分癌癥和正常細胞。配體充當它們的“眼睛”，將它們直接引向腫瘤細胞上過度表達的受體，從而在不傷害正常細胞的同時特異性攻擊惡性細胞。目前已知有無數種靶向配體在各種癌癥中過表達，不同的癌癥類型和亞型，癌癥階段也不同。圖5突出顯示了截止2018年為止與癌癥相關的前十大過表達受體及其在PubMed中的相應出版物。全面的文獻綜述顯示（除CD44和Fas受體外），所有其他受體均已用作噬菌體展示生物淘選的靶標并且已經為這些受體開發了至少一種肽配體。
 

圖5、截止2018年，PubMed中與癌癥相關的前10大過表達受體及其相應報道。
5、細胞內靶向肽的缺乏：APT STAT3的案例研究
STAT3在其與癌癥有關的信號通路中起著重要作用，因此受到了廣泛關注。有文章報道STAT3結合肽的鑒定（APT STAT3，Kd?231nmol / L）。 開發了APT STAT3與穿透細胞的肽9R（APT STAT3 -9R）的結合體，以增強細胞攝取。APT STAT3 -9R不僅阻斷了STAT3的磷酸化，而且還降低了STAT下游分子在各種類型的癌細胞（黑素瘤，乳腺癌，肺癌，肝癌和腦癌）中的表達。此外，腫瘤內注射APT STAT3 -9R在異種移植和同種異體移植腫瘤模型中的抗腫瘤活性發揮了重要作用。提出了APT STAT3作為抑制STAT3的有力藥物的臨床證明，該藥物可針對具有組成性激活的STAT3的多種癌癥（圖6）。

圖6、肽的高效細胞內傳遞。
本文通過綜合性的論述噬菌體展示技術在腫瘤靶向肽中的應用，闡述了噬菌體展示生物淘選技術為實體瘤治療帶來了巨大的高親和力和高度特異性肽配體庫。 這些許多基于肽的靶向配體在增強實體瘤治療方面已顯示出令人鼓舞的結果，包括與抗癌藥或生物制劑組合使用時，增加的腫瘤蓄積，高度特異性的腫瘤靶向和增強的腫瘤抑制作用。但是，為了成功應用到到臨床，應針對肽靶向配體的親和力，水溶性和靶標特異性進行優化。隨著技術的進步，現在可以使用結合的一級噬菌體展示篩選和二級計算優化方法來開發針對靶向實體瘤治療領域中任何目標受體的最佳肽。
 
參考文獻：Er-Wei Song, et al. 2019. Phage display screening of therapeutic peptide for cancer targeting and therapy. Protein & Cell.
Benekli M, et al. 2009.  Targeting signal transducer and activator of transcription signaling pathway in leukemias. J Clin Oncol .
 
 
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1. 固相和液相噬菌體展示文庫篩選經驗豐富，可自動化進行噬菌體展示高通量篩選，實現快速交付；
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3. 引入先進的親和力檢測技術，深入的生物信息學分析，選擇最佳的人源框架區序列快速且高通量篩選高親和力及高產量的人源化抗體；
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服務名稱	服務內容	服務周期	備注
ScFv/Fab/VHH天然抗體庫構建及篩選	多個種屬天然抗體庫構建	16-20周	周期根據庫容要求進行增減
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多肽庫構建及篩選	7肽、12肽等隨機肽庫構建	12-16周
雙特異性抗體定制	雙特異性抗體定制	請咨詢
抗體人源化	人源化設計-IgG表達及親和力排序-抗體純化和親和力測定	請咨詢

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1. 在疫苗研發中的應用
2. 抗體模擬表位篩選
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