前言

瘢痕疙瘩是機體皮膚受到創傷后，在修復過程中由于真皮成纖維細胞過度增生和過剩的細胞外基質沉積尤其是以膠原沉積和排列紊亂為特征的一種病理性瘢痕，主要表現為高出正常皮膚表面、超出原始損傷范圍、呈持續性生長的腫塊，質地較硬，彈性較差，伴有瘙癢或疼痛。單細胞測序技術加強了研究者對瘢痕疙瘩以及其他纖維化疾病的了解，然而這些研究主要集中在成纖維細胞（Fibroblast，FB）的細胞異質性上。為了解析瘢痕疙瘩的發病機制，需要更加全面理解皮膚中其他細胞的分子特征，如血管內皮細胞（Endothelium Cell，EC）。2022年2月在The Journal of Investigative Dermatology上發表的Integrated analysis of single-cell and spatial transcriptomics in keloids: Highlights on fibro-vascular interactions in keloid pathogenesis 一文中（IF:8.55），首爾成均館大學醫學院Lee JongHee團隊使用單細胞RNA測序（scRNA-seq）和空間轉錄組（Spatial Transcriptomics，ST）兩種技術揭示了瘢痕疙瘩潛在的病理機制。
 
 
單細胞轉錄組測序
 
作者在兩名患者（#1#3）的瘢痕疙瘩中心區域通過組織活檢取樣，并對#3患者的成熟疤痕進行取樣，之后進行單細胞轉錄組測序。利用已發表的一組五人正常皮膚樣本的單細胞轉錄組數據，用以表征瘢痕疙瘩的異質性。對于兩個瘢痕疙瘩樣本和五個正常皮膚樣本使用無監督聚類，即不依靠marker基因進行分類，得到31個細胞簇。再依據源于差異表達基因（DEG）分析的細胞特異性標記將31個簇分為了15個已知的細胞譜系（圖1 d）。
   
 
疾病相關成纖維細胞亞群
 
作者為了確定瘢痕疙瘩中FB的異質性，對11562個細胞成纖維細胞重新聚類，區分出7個FB亞群，其中4個亞群由已報道研究中的marker基因確定：FB3（間充質FB）、FB5（分泌性乳頭狀FB）、FB6（分泌網狀FB）和FB7（促炎FB）。再根據瘢痕疙瘩與正常皮膚的比例進一步定義了FB1、FB2和FB4（圖2 b）。FB1和FB2簇由來自瘢痕疙瘩病變的90.5%細胞組成，而FB4簇由來自正常皮膚的87.3%細胞組成。為確定瘢痕疙瘩和正常皮膚FB內的細胞狀態差異，作者進行了細胞軌跡分析，指定富含正常皮膚的FB4簇為“開始狀態”，分析顯示FB1或FB2（富含瘢痕疙瘩的簇）是“終端狀態”，并標注簇從正常皮膚FB分化到瘢痕疙瘩FB的途徑。再對比了FB4和FB1、FB2之間的DEG并進行GO富集分析（圖2 f）。
  圖 2 瘢痕疙瘩和正常皮膚FB的聚類揭示了瘢痕疙瘩的基質異質性
(a) FB亞類的 UMAP 投影。(b)FB亞群中每個亞細胞狀態的組織起源的相對比例。(c)小提琴圖代表 FB 亞群中一組明顯表達的基因。(d)左：擬時序分析顯示FB譜系從FB4“起始狀態”（黑色箭頭）到“終止狀態”（紅色箭頭）的分化途 徑。右圖：突出顯示“起始狀態”和“終止狀態”的劃分的偽時序細胞排序。擬時序被描繪為紫色到黃色。(e)瘢痕疙瘩FB中差異表達基因的聚類熱圖。(f)在瘢痕疙瘩 FBs 中上調基因的GO富集分析。(g)瘢痕疙瘩FB的代表性GSEA途徑。FB，成纖維細胞；EMT，上皮間質轉化。
 
 
整合空間轉錄組數據
 
為了進一步評估瘢痕疙瘩組織以及FB的空間異質性，作者對兩名患者（#1#2）的瘢痕組織樣本以及兩個正常人的皮膚切片進行空間轉錄組分析。首先根據瘢痕疙瘩marker基因轉錄水平進行瘢痕疙瘩評分，以定位組織中活躍的瘢痕疙瘩位點。作者方向高評分位點確實特異性定位在瘢痕疙瘩部位，病變程度深的位點評分更高，并且高評分位點主要位于內皮轉錄本周圍，這突出了纖維血管生態位在病變機制中的潛在作用。
  (a) ST載玻片的H&E染色和患者#2中ST位點的無偏聚類。(b)顯示共享瘢痕疙瘩標記基因的維恩圖和特征圖。(c-d)小提琴圖描繪了樣本來源(c)和ST點簇(d)的瘢痕疙瘩評分。(e)描繪瘢痕疙瘩評分（黑色箭頭）和內皮轉錄本（紅色箭頭）的空間圖。(f)患者#1的UMAP 圖。(g-h)瘢痕疙瘩評分(g)和細胞類型預測評分(h)覆蓋在 H&E 圖像上。富集 FB2 簇（橙色箭頭）的點，表達MMP11和MMP14，分布在富集 FB1 點的前緣。比例尺 = 0.5 mm。
 
 
瘢痕疙瘩內皮細胞的間充質激活
 
由于EC和FB有密切的互作，作者對EC進行聚類并解析細胞異質性，對scRNA-seq數據進行無監督分析，得到七個亞類（EC1-EC7）。其中，EC3簇90.3%由來自瘢痕疙瘩樣本的細胞組成，并有獨特的表達譜。這樣的表達譜類似于傷口愈合時間充質激活過程。與正常皮膚EC相比，這些特征基因也在瘢痕疙瘩的EC亞群特異性表達。為進一步證明瘢痕疙瘩中發生間充質激活，作者進行了mIF，觀察到疙瘩標記基因中POSTN與血管標志物CD31共定位。
  (a)EC亞群的UMAP投影。與正常皮膚EC相比，瘢痕疙瘩EC中的EC3亞群顯著增加。(b)顯示選定標記基因表達的點圖。(c)小提琴圖顯示了瘢痕疙瘩EC和正常EC之間EC3的五個代表性基因的表達。(d)瘢痕疙瘩真皮和正常真皮代表性切片中CD31、POSTN、α-SMA、CD8和Ki-67的mIF染色。箭頭表示瘢痕疙瘩EC的間充質激活。(e)跨52個ROI的POSTN/CD31雙陽性細胞的定量；分別來自CD31的2,853個細胞和1,665個細胞瘢痕疙瘩細胞和CD31正常皮膚細胞。比例尺=0.05mm。
 
 
空間轉錄組驗證瘢痕疙瘩中潛在的細胞互作
 
作者進行了細胞間互作分析，發現在瘢痕疙瘩EC中觀察到更多相互作用（圖5 a），其中有已知重要的TGFB3-TGFBR2通路，能夠促進EC增殖與遷移。分析預測了瘢痕疙瘩EC通過與間充質激活相關配體來調節瘢痕疙瘩FB，并且瘢痕疙瘩中TGF-β信號傳導互作發生顯著改變。
為了驗證預測的互作，作者將配體-受體對的表達映射在空間轉錄組切片上，發現了TGFB1-TGFBR2以及TGFB3-TGFBR2大量共定位（圖5b-c）。而瘢痕疙瘩EC中SMAD1和SMAD5的高表達證明了TGF-β信號傳導的激活（圖5 f），并且TGF-β配體-受體共定位的位點在瘢痕疙瘩中顯著富集（圖5 d）。這驗證了失調的TGF-β/SMAD信號會通過促進血管形成以刺激異常纖維化以促進瘢痕疙瘩形成。
  (a)描繪FB和EC亞群之間的細胞間互作的Circos圖。橙線表示TGFB3-TGFBR2互作。（b-d）TGFB1-TGFBR2和TGFB3-TGFBR2互作的共定位覆蓋在ST部分上。(e)特征圖顯示與瘢痕疙瘩FB和正常FB中的新血管形成相關的潛在的配體表達差異。(f)TGF-β信號（SMAD1和SMAD5）和VEGF受體（FLT1和KDR）的小提琴圖分別在瘢痕疙瘩EC和正常EC上的表達。(g)ST載玻片中VEGFA-FLT1和VEGFA-KDR互作的共定位。（h）條形圖分別描繪了瘢痕疙瘩和正常皮膚切片中受體-配體共表達斑點的百分比。比例尺=0.5毫米。
 
作者對比了從#3患者獲得的成熟疤痕單細胞轉錄譜，發現了瘢痕疙瘩中表達POSTN、ADAM12和TGFBI的FB亞群比例更高，而且瘢痕疙瘩EC的間充質激活現象更加顯著。這可以作為瘢痕疙瘩的一個關鍵特征。
  (a)瘢痕疙瘩(Ke02)和成熟疤痕(MS02)的臨床照片。(b)患者#3切片的H&E染色。(c)患者匹配樣本單細胞轉錄組的FB亞群的UMAP圖。(d)小提琴圖代表FB亞群中的一組標記基因。(e)將瘢痕疙瘩評分投影在FB亞群的UMAP圖上。(f)左：瘢痕疙瘩和成熟疤痕FB亞群中四個FB亞群的相對比例。右圖：四個FB亞群中細胞的瘢痕疙瘩評分。（G）顯示EC亞群的選定血管標記基因表達的點圖。FB，成纖維細胞；EC，內皮細胞。比例尺=0.1mm。
 
 
總結
 
作者以單細胞分辨率描繪了瘢痕疙瘩的細胞景觀，通過scRNA-seq分析可以將FB分成7個亞群，證實了表達POSTN、ADAM12、TGFBI的FB亞群的異質性，并在纖維化皮膚病中起重要作用。將scRNA-seq分析出的瘢痕疙瘩標記基因映射到瘢痕疙瘩空間轉錄組切片上，發現瘢痕疙瘩評分高的位點主要位于血管周圍，說明纖維血管相互作用可能在病程發展中起重要作用。由于瘢痕疙瘩EC在轉錄上與組織缺血或傷口愈合過程中EC間充質激活類似，說明瘢痕疙瘩EC的間充質激活可能與新生血管形成有關，并促進了瘢痕疙瘩發展。作者根據空間轉錄組對配體-受體互相作用進行精細定位，發現了過表達的TGF-β/SMAD信號會通過促進血管形成以刺激異常纖維化以促進瘢痕疙瘩形成。雖然此研究沒有與患者匹配正常皮膚的對照，但研究了患者匹配成熟正常疤痕，同樣發現了FB細胞的異質性以及EC間充質激活差異。
  研究FB細胞異質性和EC-FB配體-受體對空間位置涉及到空間轉錄組。
 
參考文獻
Shim J, Oh SJ, Yeo E, et al. Integrated analysis of single-cell and spatial transcriptomics in keloids: Highlights on fibro-vascular interactions in keloid pathogenesis [published online ahead of print, 2022 Feb 3]. J Invest Dermatol. 2022;S0022-202X(22)00085-9. doi:10.1016/j.jid.2022.01.017