芐基異喹啉生物堿 (BIA) 是植物中的一組多樣化的含氮次級(jí)代謝物，僅存在于有限的植物科。具有藥理意義，典型的藥用 BIA 包括嗎啡和可待因（麻醉性鎮(zhèn)痛劑）、血根堿和小檗堿（抗微生物劑）、筒箭毒堿和罌粟堿（肌肉松弛劑）以及諾卡品（止咳劑和抗癌劑）。然而，人們對(duì)BIA的生物合成和調(diào)控知之甚少，本文章表明荷花兩個(gè)III組WRKY轉(zhuǎn)錄因子(TFs)，NnWRKY70a和NnWRKY70b，正向調(diào)控荷花中BIA的生物合成。且兩種 NnWRKY70 都對(duì)茉莉酸 (JA) 有反應(yīng)，它們的表達(dá)譜與 BIA 濃度和 BIA 通路基因表達(dá)高度相關(guān)。為 WRKY TF 在次級(jí)代謝物生物合成中的調(diào)節(jié)作用提供了有用的見解。

3.1 荷花WRKY70s的核苷酸和蛋白質(zhì)序列特征比較

     兩個(gè) NnWRKY70s和其他先前表征的參與植物次生代謝調(diào)節(jié)的 WRKY 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。NnWRKY70a和NnWRKY70b 與參與調(diào)節(jié)擬南芥，長(zhǎng)春花和短冬青的 MIA 生物合成的AtWRKY70，CrWRKY1和OpWRKY1序列相似性很高（A）。且WRKY 結(jié)構(gòu)域中都包含一個(gè)核心七肽WRKYGQK和一個(gè)保守的鋅指基序 CX₇CX₂₃HXC（B）。表明NnWRKY70a 和NnWRKY70b 都是典型 III 組 WRKY 蛋白。

3.2 NnWRKY70s 的表達(dá)譜和亞細(xì)胞定位

通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)NnWRKY70 s在不同荷花器官中的空間表達(dá)譜進(jìn)行了判定，其中NnWRKY70b主要在蓮藕中表達(dá)，其次是根莖和葉，NnWRKY70a在荷葉中表達(dá)（A）。而針對(duì)荷葉不同發(fā)育階段 (S1-S7) ，兩個(gè)NnWRKY70基因表現(xiàn)出非常相似的表達(dá)模式，在整個(gè)測(cè)試的發(fā)育階段都持續(xù)增加（B）。將NnWRKY70s的編碼區(qū)與GFP報(bào)告基因融合在本氏煙草中過表達(dá)來進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析, 表明 NnWRKY70a和NnWRKY70b 蛋白都有明顯的核定位（C）。

3.3  NnWRKY70 是反式激活 BIA 通路基因啟動(dòng)子的 JA 響應(yīng) TF

已知 JA 通過激活 JA 響應(yīng)性 TF 來觸發(fā)大多數(shù)導(dǎo)致次級(jí)代謝物的生物合成途徑，為了驗(yàn)證NnWRKY70是否對(duì) JA 有反應(yīng)，通過檢測(cè)它們?cè)贛eJA 處理后的樣本中的表達(dá)，結(jié)果顯示表達(dá)量在24h時(shí)增加了約5倍（A）；為了尋找NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 啟動(dòng) BIA 生物合成的啟動(dòng)子區(qū)域，通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選的NnTYDC1、NnCYP80G和Nn7OMT初步確定，NnWRKY70a 只能激活pNnTYDC1啟動(dòng)子（B），而NnWRKY70b 可以激活pNnTYDC1、pNnCYP80G和pNn7OMT2三個(gè)啟動(dòng)子（C）。為進(jìn)一步確定 NnWRKY70a 和 NnWRKY70b與這些啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)，將正常啟動(dòng)子與缺失保守區(qū)域W-box的啟動(dòng)子進(jìn)行酵母單雜驗(yàn)證，結(jié)果顯示NnWRKY70b 與 pNnTYDC1 和 pNnCYP719A 結(jié)合，與pNnCYP80G，pNn7OMT弱結(jié)合（D），NnWRKY70a 明顯與pNnCYP80G，PNnCYP719A結(jié)合，與PNnTYDC1和PNn7OMT弱結(jié)合，與NnNCS1啟動(dòng)子均未結(jié)合。當(dāng)從這些啟動(dòng)子中去除 W-box 時(shí)，它們都沒有與 NnWRKY70a 或 NnWRKY70b 結(jié)合（D）。表明 NnWRKY70a 或 NnWRKY70b與 BIA 生物合成基因啟動(dòng)子中的 W-box順式元件特異性結(jié)合，從而激活JA 響應(yīng)性 TF 來觸發(fā)大多數(shù)導(dǎo)致次級(jí)代謝物的生物合成途徑。

3.4  NnWRKY70s的過表達(dá)增強(qiáng)了荷花中的 BIA 積累

為了進(jìn)一步確定 NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 是否激活荷花中的 BIA 生物合成，通過檢測(cè)攜帶過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌浸潤(rùn)的花瓣，結(jié)果顯示增強(qiáng)了荷花花瓣中的 BIA 含量，同時(shí)發(fā)現(xiàn)NnWRKY70a或NnWRKY70b的過表達(dá)顯著促進(jìn)BIA 途徑基因NnCYP80G、NnCNMT、Nn7OMT和NnCYP719A的轉(zhuǎn)錄，表明兩個(gè) NnWRKY70 之間可能存在交互激活能力， NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 都參與了植物中的 BIA生物合成。

3.5  NnWRKY70b 與 NnWRKY70a、NnWRKY53b 和 NnJAZ1 蛋白發(fā)生物理相互作用

通過酵母雙雜交cDNA文庫(kù)篩選試驗(yàn)進(jìn)一步研究NnWRKY70s和其他蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)荷花 BIA 生物合成中可能的相互作用。選擇調(diào)節(jié) BIA 生物合成的更為顯著的NnWRKY70b進(jìn)行研究，由于全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)顯示出強(qiáng)烈的自激活活性，因此將保留WRKY 和鋅指結(jié)構(gòu)域的截短區(qū)域作為誘餌（A），將篩選得到的陽(yáng)性結(jié)果做進(jìn)一步的雜交驗(yàn)證，得到NnWRKY70b 與 NnWRKY70a、NnWRKY70b 與 NnWRKY53b 以及 NnWRKY70b與NnJAZ1的互作結(jié)果（B），雙分子熒光互補(bǔ) (BiFC) 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定它們之間的互作關(guān)系。

在該項(xiàng)研究中，作者通過：（1）系統(tǒng)發(fā)育分析表明，NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 為典型的可參與植物次生代謝調(diào)節(jié)的III 組 WRKY蛋白；（2）雙熒光素酶和酵母單雜交實(shí)驗(yàn)表明，NnWRKY70a 和 NnWRKY70b 可以特異性結(jié)合BIA 途徑基因啟動(dòng)子的 W-box順式元件，從而正向調(diào)節(jié)荷花 BIA 生物合成，NnWRKY70b 的 BIA 生物合成激活比 NnWRKY70a 更強(qiáng)；（3）酵母雙雜交和 BiFC 分析進(jìn)一步揭示NnWRKY70b通過與在調(diào)節(jié)荷花 BIA 生物合成中的關(guān)鍵蛋白之間的相互作用，調(diào)節(jié)荷花 BIA 生物合成。以上的研究結(jié)果證明了 NnWRKY70 TFs 在激活荷花中 BIA 的生物合成中的積極調(diào)節(jié)作用，并為通過基于 TF 的基因工程提高 BIA 產(chǎn)量提供了可行的策略。