分子互作是生命體的普遍主題，分子互作技術作為生命科學的基礎技術現已廣泛應用于生命科學研究的方方面面。本文是分子互作專欄的第一篇文章，主題是“基因與基因互作”。

雙熒光素酶實驗-原理

    螢火蟲熒光素酶可以催化熒光素氧化成oxyluciferin，在熒光素氧化的過程中，會發出生物熒光，生物熒光可以通過酶標儀進行測定。

    海腎熒光素酶可以催化腔腸素氧化成coelenteramide，在腔腸素氧化的過程中，會發出生物熒光，生物熒光可以通過酶標儀進行測定。

    先以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶，后以腸腔素為底物來檢測海腎螢光素酶，并且在后續加入腔腸素時，同時加入抑制螢火蟲熒光素酶催化熒光素發光的物質，使后續檢測僅僅檢測到海腎熒光素酶的活性，實現雙熒光素酶報告基因檢測。通過熒光素酶和其底物這一生物發光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達。

    把感興趣基因的5’啟動子區克隆在熒光素酶的上游，或把3’-UTR區克隆在熒光素酶的下游等，構建成報告基因(reporter gene)質粒。然后與轉錄因子表達質粒，或miRNA mimics共轉染細胞，裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低來判斷轉錄因子或miRNA對目的基因的轉錄調控作用。

    海腎熒光素酶相對更多地被用作轉染效率的內參，以消除細胞數量和轉染效率的差異。螢火蟲熒光素酶催化熒光素發光的最強發光波長為560nm；海腎熒光素酶催化腔腸素發光的最強發光波長為465nm。

應用案例
1、雙熒光素酶應用之驗證轉錄因子與啟動子互作
    例：驗證E2F1轉錄因子與IL6啟動子互作（PMID：32044038）

    首先在ensembl網站( asia.ensembl.org/index.html )查找IL6啟動子序列，其次在JASPAR網站( jaspar.genereg.net/ )預測互作。

實驗材料

    細胞：293T或客戶指定細胞（客戶指定細胞系不保證轉染效率）

    質粒：

      ①轉錄因子序列構建到pcDNA3.1；

      ②啟動子序列構建到pGL3-basic；（互作位點200bp左右）

      ③內參質粒PRL-TK。

2、雙熒光素酶應用之驗證miRNA與mRNA互作

    例：驗證has-miR-1270與CENPM 3’UTR互作（PMID：31703591，IF=4.357）

    在starbase網站預測互作

注意事項

    QA及送樣注意事項

     熒光素酶報告基因檢測常見問題與解答

      Q: 熒光素酶報告基因檢測主要有哪些用途？ 

      a.啟動子結構分析，將啟動子區域序列（通常2k左右）進行分段截短，或對特定位點進行突變，再分別構建入luciferase報告載體，檢測其啟動子活性。

      b.啟動子SNP分析，一些基因的啟動子區域存在單核苷酸多態性，可運用熒光素酶報告系統分析其相對活性。

      c.驗證特定轉錄因子同其調控序列的作用，將該序列（通常為啟動子區域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞中共轉過表達該轉錄因子，可分析轉錄因子過表達是否提高熒光素酶活性。

      d.可以分析信號通路是否激活，將該信號通路的下游響應原件序列構建入報告基因載體，在不同上游信號條件下，熒光素酶活性代表了通路的下游響應。例如在GPCR研究中，將cAMP response element（CRE）載入報告基因載體，構建穩定表達細胞株后，可以用于分析GPRC的激活與抑制劑篩選。又如，將HIF1α的響應原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase報告載體構建穩轉細胞株，可以用于低氧相關通路的研究。

      e.驗證microRNA的靶序列，將待測的3’UTR序列插入報告基因載體，再共轉入該microRNA，如果熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。

      Q : 在金開瑞做熒光素酶報告基因檢測，需要提供什么？實驗結果包括哪些？

      您需要提供：1.基因序列或者模板，需提供詳細的轉錄因子、目的基因或microRNA信息；2.實驗細胞，如無特殊要求，金開瑞默認為使用293T細胞，則無需提供（金開瑞暫時只開展293T細胞的雙熒光素酶實驗）。

      實驗結束后，金開瑞會為您提供實驗流程及完整報告一份，包括實驗原始數據、圖片、分析結果等。

      Q: 熒光素酶作為報告基因相比于熒光蛋白有哪些優勢？

      Luciferase的靈敏度相比于GFP提高10-100倍以上，同時具有更寬的動態范圍，便于數值分析比較，不需要熒光顯微鏡，而且在活體實驗中其熒光穿透性高于EGFP等熒光蛋白，同時由于沒有內源活性、其本底信號很低。

      而GFP等熒光蛋白相比于熒光素酶的優勢在于可以進行失蹤定位，并且其觀測不需裂解細胞，方便進行適時觀察。

      Q : 海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶相比，相對活性如何？

      在氧、鎂和ATP的存在下，螢火蟲熒光素酶作用于螢火蟲熒光素，而來源于海洋腔腸（Renilla reniformis)的熒光素酶在氧的存在下作用于海腎熒光素。雙報告基因技術（Dual-reporter assays）,結合了螢火蟲熒光素酶測試和海腎熒光素酶測試。

      Q : 雙熒光素酶報告基因實驗轉染效率很低而且復孔重復不出來是什么原因？

      轉染效率低的話可以從三個方面改善，首先要確保細胞狀態是好的，通常我們選出處于分裂期的細胞，另外陽性對照您可以選擇過表達的熒光蛋白質粒，還有就是DNA的質量尤為重要，最好是先酶切驗證。

      這個實驗檢測結果很靈敏，有一定差異是正常的，通常只要確保它在一個數量級之內即可。如果差異超出這個范圍可以從兩方面改善，一是記住保持樣本的均一性，二是加樣要準確。

限時活動

    雙熒光素酶檢測服務限時大促將于6月30日截止，感興趣的客戶可以參與噢：

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