分子互作是生命體的普遍主題，分子互作技術(shù)作為生命科學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的方方面面。本文是分子互作專欄的第二篇文章，主題是“蛋白-蛋白互作”。

Co-IP原理

    免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物中的未知蛋白組分，是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。

     其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。目前多用精制的protein A/G預(yù)先結(jié)合固化在瓊脂糖的磁珠上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的protein A/G就能吸附抗原達到精制的目的。

    補充：Protein A、Protein G是最常應(yīng)用于抗體親和純化和免疫沉淀的蛋白。將Protein A、G分別固定在不同的介質(zhì)上，或同時將Protein A、G共價偶聯(lián)到介質(zhì)表面，是從腹水、細胞培養(yǎng)物上清和血清中分離IgG和IgG亞家族的有效工具。
將蛋白樣本Protein A和Protein G純化IgG，IgG片段和亞類的基礎(chǔ)是二者對IgG-類型的多克隆抗體和單克隆抗體具有很高的特異性親和力。

Protein A 和Protein G

Co-IP技術(shù)路線
    1.Co-IP 前WB：提取樣本總蛋白，通過抗體檢測樣本中靶蛋白的表達水平，如果檢測到目的蛋白條帶，則進行IP實驗； 

    目的：驗證靶蛋白和互作蛋白在目標樣本內(nèi)是否表達；驗證抗體的特異性。

    2.免疫沉淀：用靶蛋白對應(yīng)的IP級別抗體將靶蛋白從樣本總蛋白中富集下來

    3.Co-IP后WB：對IP實驗的IgG和IP組進行WB鑒定，如果IP組能檢測到靶蛋白，而IgG組不能檢測到靶蛋白，則說明富集成功；

    4.質(zhì)譜鑒定：在IP成功的基礎(chǔ)上，對IgG組和IP組進行銀染SDS-PAGE檢測，如果IgG組與IP組有明顯差異，則對IgG組和IP組的樣本進行質(zhì)譜鑒定。

Co-IP免疫共沉淀的優(yōu)缺點

優(yōu)點：

    直接分析蛋白質(zhì)的相互作用：Co-IP可以通過特異性抗體選擇性地沉淀靶蛋白及其相互作用蛋白，從而直接研究它們的相互作用關(guān)系。

    保留蛋白質(zhì)的生理環(huán)境：Co-IP通常在非變性條件下進行，能夠保留蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象和生物活性，有利于研究生物過程中的蛋白質(zhì)相互作用。

    高度特異性：通過使用特異性抗體，Co-IP可以選擇性地富集目標蛋白及其相互作用蛋白，降低非特異性結(jié)合的背景干擾。

    可用于低豐度蛋白質(zhì)的分析：Co-IP可以有效富集低豐度的相互作用蛋白，增加對其研究的靈敏性。

    結(jié)合其他技術(shù)應(yīng)用：Co-IP可以與其他技術(shù)，如質(zhì)譜分析、Western blot等結(jié)合使用，進一步鑒定和驗證蛋白質(zhì)相互作用的特性。

缺點：

    限于已知的相互作用關(guān)系：Co-IP需要事先知道靶蛋白及其相互作用蛋白的抗體信息，因此對未知的蛋白質(zhì)相互作用難以進行研究。

    假陽性和假陰性：Co-IP在實驗過程中存在假陽性和假陰性的可能性，需要進行嚴格的對照實驗和數(shù)據(jù)驗證。

    依賴特異性抗體的質(zhì)量：Co-IP的成功與否關(guān)鍵取決于抗體的特異性和親和力，因此需要確保使用高質(zhì)量的抗體。

    技術(shù)復(fù)雜性：Co-IP需要一系列實驗步驟，包括免疫沉淀、洗滌、蛋白質(zhì)解析和檢測等，技術(shù)上較為復(fù)雜，需要經(jīng)驗豐富的實驗者進行操作。

Co-IP項目風(fēng)險點及解決方案

    風(fēng)險點1：抗體非IP級別的或者抗體不能識別目標樣本所屬物種

    解決方案：選用IP級別并且能夠識別目標樣本物種的抗體

    風(fēng)險點2：拉取互作蛋白中沒有客戶想要的（第一有可能是拉下來了，但蛋白信號弱，在其他高峰度蛋白的信號掩蓋下，儀器未能識別到客戶所想蛋白）

    解決方案：建議做WB直接進行驗證，看客戶所想蛋白是否在里面，WB會有信號放大作用，效果比質(zhì)譜鑒定進行篩選更合適些，質(zhì)譜只使用與廣篩；第二可以嘗試其他方式進行驗證，例如GST pull down，酵母雜交等不同方法多角度進行嘗試驗

    風(fēng)險點3：外源轉(zhuǎn)入的蛋白在目標樣本中不表達

    解決方案：盡量不要跨物種表達

    風(fēng)險點4：標簽蛋白轉(zhuǎn)染細胞WB不能檢測到目的蛋白：

    解決方案：推薦換標簽或者換較為容易轉(zhuǎn)染的細胞，另外盡可能的轉(zhuǎn)染與基因所屬物種最接近的細胞，避免物種間的排斥反應(yīng)引起的不表達。

Co-IP送樣指南
    Co-IP實驗需要保證足夠的蛋白濃度才能維持原本存在的蛋白互作狀態(tài)，尤其當?shù)鞍棕S度較低、相互作用力不強、使用蛋白不易提取的組織樣本等情況時。而且Co-IP的實驗條件往往需要反復(fù)摸索。因此用于Co-IP實驗需準備：

    ①細胞：Co-IP-WB細胞沉淀不少于80ul（至少2皿細胞量），Co-IP-MS細胞沉淀不少于100ul（大概4皿細胞），干冰寄送；

    ②動物組織：不少于0.5g，新鮮取材，干冰寄送；

    ③植物組織：不少于1g，新鮮幼嫩組織，干冰寄送

    抗體用量要求：抗體≥30ul抗體/次

Q&A

1、Co-IP 實驗成功的評判標準是什么？

    在Co-IP-WB鑒定結(jié)果中，IgG組無目的蛋白條帶、IP組有目的蛋白條帶，說明IP過程成功；銀染圖中，IP組對于IgG組有更多蛋白條帶、且存在差異，說明co-IP過程檢測到互作蛋白；IP產(chǎn)物在質(zhì)譜檢測中鑒定到的蛋白數(shù)量不能作為判斷實驗成敗的標準，因為這取決于目的蛋白本身所具有的互作蛋白數(shù)量、結(jié)合力強弱等方面。

2、IgG 組及IP 組均檢測到目的條帶，為什么？

    如果遇到這種情況可能是在切膠及質(zhì)譜樣品處理過程中發(fā)生了串染，對IP組中互作蛋白的結(jié)論沒有影響，IgG組中的蛋白在文章中通常都不是考察對象。

3、Co-IP實驗成敗的主要因素？

    a.所使用的抗體不僅需要優(yōu)秀的親和力、特異性，其識別表位還可能被互作蛋白所掩蔽（主要是使用單抗時）；

    b.當?shù)鞍谆プ黜毎l(fā)生在特定生理代謝條件、組織細胞類型之中時，co-IP實驗可能無法獲得互作結(jié)果；

    c.如果誘餌蛋白和或捕獲蛋白在樣本中豐度很低時，會導(dǎo)致結(jié)果失敗；

    d.兩個互作蛋白的親和力較弱；

    e.當該蛋白互作需要較特定的離子強度，或者需要如Ca離子/Mg離子/ATP等輔因子時，要創(chuàng)造合適的反應(yīng)條件會變得困難；

    f.一些樣品處理提取存在難度，提取足量目的蛋白與保持蛋白天然狀態(tài)，需通過實驗條件達到優(yōu)化平衡；