分子互作是生命體的普遍主題，分子互作技術作為生命科學的基礎技術現已廣泛應用于生命科學研究的方方面面。本文是分子互作專欄的第三篇文章，主題是“蛋白-DNA互作專題之EMSA”。
 

  EMSA原理  

    凝膠遷移或電泳遷移率實驗 (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一種研究DNA 結合蛋白和其相關的 DNA 結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析( HellmanLM and Fried MG, 2007) 。

    這一技術最初用于研究 DNA 結合蛋白，目前也可用于研究 RNA結合蛋白和特定的 RNA 序列的相互作用 (Rio, 2018)。在實驗中，通常將純化的蛋白或細胞粗提液和生物素標記的 DNA 或 RNA 探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。

    其中 DNA-復合物或 RNA-復合物比非結合的探針移動得慢，而探針移動的較快。EMSA實驗根據實驗方案設計的不同，分為驗證型 EMSA、競爭型 EMSA和超遷移 EMSA。

  驗證型EMSA  

    用于驗證探針是否含有可與蛋白質結合的位點。探針與純化蛋白混合孵育，探針與蛋白結合與否，可以直接表明探針和蛋白的互做關系。蛋白提取液中蛋白質混雜，種類不單一，探針可能與多種蛋白結合。

    因此，探針與蛋白提取液混合孵育，可以驗證探針上是否含有蛋白結合位點，但是無法得知是何種蛋白與探針結合。

  競爭型EMSA  

    與探針序列相同，不含修飾基團的 DNA 片段稱為冷探針。

    在探針與蛋白質混合液中加入大量冷探針，冷探針含有和探針相同的 DNA 序列，會干擾探針與蛋白的結合。在電泳圖的相應位置處，電泳帶的的信號減弱或消失。

    探針和蛋白的結合未必是特異性結合，或者蛋白本身可能含有生物素，二者均能產生假陽性的實驗結果。增加一個冷探針的干擾實驗，可以排除假陽性結果，增加實驗結果的準確性。

  超遷移EMSA  

    超遷移 EMSA 利用到了與待檢測的目的蛋白特異性結合的抗體。

    如果蛋白質溶液不是單一的純化蛋白，無論是驗證型 EMSA，還是競爭型 EMSA，都無法證明和探針結合的蛋白質就是我們所預期的。在實驗體系中引入特異性抗體，用抗體特異性地結合蛋白-探針復合物，這就是超遷移 EMSA。

    蛋白-探針復合物被抗體識別并結合，該三聚復合物在凝膠電泳中，遷移速率再次增大，電泳帶出現在蛋白-探針復合物的上方。超遷移 EMSA 是以競爭型 EMSA 為基礎的實驗方案。

    超遷移 EMSA 的實驗結果可以很好地驗證探針是否和蛋白結合，是否是特異性結合，與探針結合的蛋白是否是預期的蛋白質。

  EMSA技術路線  

  實驗流程：
    1、細胞總蛋白/核蛋白提取，或者蛋白外源表達；（總量≥100μg，純度＞80%、濃度＞0.5ug/μl）

    2、DNA探針合成及生物素標記；

    3、泳道設定及濃度梯度設定（需客戶提供上樣順序）；

    4、DNA-蛋白凝膠電泳；

    5、轉膜；

    6、紫外燈交聯；

    7、化學發光顯色反應；

  EMSA送樣要求：

    ①細胞沉淀：不少于20μl，細胞＞10⁷，干冰寄送；

    ②動物組織：不少于0.2g，新鮮取材，干冰寄送；

    ③植物組織：不少于0.5g，新鮮幼嫩組織，干冰寄送；

    ④重組蛋白不少于50μg（NTA或TE溶）；

    shift-EMSA需提供IP級別抗體，不少于10μl。

  注意事項：

    蛋白盡量在上清中表達，包涵體中蛋白在復性過程中可能不能完全復性，導致蛋白空間結構不能完全恢復，這樣可能影響EMSA實驗中與DNA的結合，需提前給客戶說明。

  解決方法：
    ①前期蛋白表達難易度評估時，對預計可溶性不佳的蛋白（或沉淀可能性大的蛋白），或蛋白預計不可溶，建議連親水標簽pet-sumo；

    ②可以先考慮包涵體復性，其次可考慮跟客戶溝通換載體、換表達系統等；

    ③優化實驗條件，如低溫16℃、高溫37℃誘導蛋白表達，盡量降低蛋白折疊的可能性。

  案例分享：