分子互作 | 蛋白-蛋白互作專題之GST pull-down
一、GST pull down 實驗簡介
GST pull down是常用的蛋白與蛋白互作實驗方法,利用帶有標簽的已知蛋白作為誘餌蛋白(最常用的是GST標簽,即谷胱甘肽巰基轉移酶,glutathione S-transferase),誘餌蛋白特異性結合谷胱甘肽親和樹脂,當目的蛋白溶液過柱時,將誘餌蛋白及其相互作用的蛋白復合物捕獲。復合物洗脫后,通過蛋白凝膠電泳分析兩種蛋白間的相互作用,或者篩選相應的目的蛋白。
二、應用背景
通過蛋白-蛋白互作的研究技術GST pull down這個實驗,研究人員能夠探究蛋白質之間的相互作用,揭示細胞內復雜的信號傳遞和調控網絡。這不僅有助于我們對疾病發生機制的理解,還為藥物研發和治療策略的開發提供了重要的參考。
三、GST pull down原理簡介
四、pull down實驗流程
(1)蛋白提取與蛋白濃度測定;
(2)pull down前WB檢測誘餌蛋白及獵物蛋白的表達;
(3)pull down實驗,包括以下步驟:
a.磁珠準備,將磁珠分裝且標記為實驗組和對照組,用預冷的IP洗滌液重懸磁珠;
b.磁珠結合誘餌蛋白GST-A(實驗組加誘餌蛋白GST-A,對照組加標簽GST蛋白),靜音混合2h后用預冷的IP洗滌液進行洗滌重懸磁珠;
c.誘餌蛋白結合互作蛋白His-B(實驗組合對照組分別加入His-B或總蛋白),4℃靜音混合過夜(約16h)后用預冷的IP洗滌液進行洗滌重懸磁珠;
d.洗脫;
(4)pull down后WB檢測或者MS檢測。
五、樣品類型
1、兩個已知蛋白的互作驗證
兩個重組表達蛋白需帶不同標簽,至少有一個帶GST或HIS標簽,重組蛋白≥200ug,蛋白濃度0.1mg/ml以上,純度≥85%,上清表達為宜,包涵體表達需做掛柱測試。
2、已知蛋白篩選互作蛋白
①重組表達蛋白,帶GST或HIS標簽(重組蛋白≥200ug,蛋白濃度0.1mg/ml以上,純度≥85%,上清表達為宜,包涵體表達需做掛柱測試)
②總蛋白(提供細胞沉淀或新鮮動植物組織)
六、應用延伸
GST pull-down實驗的誘餌蛋白除了可以帶GST標簽外,還可以帶HiS標簽,則稱HiS pull-down實驗,也有使用多肽或者化合物進行pull down實驗,稱為多肽pull-down或者化合物pull-down實驗。
七、實驗常見問題
1、IP、Co-IP、pull-down的區別?
通常IP或coIP使用組織細胞材料,靶蛋白為內源天然蛋白或組織細胞中過表達蛋白(可融合標簽)。Pull-down中的誘餌蛋白一般經重組表達獲得。IP和coIP需要使用親和力好的一抗,選購時需注意相應驗證數據。
簡單來說,IP捕獲目的蛋白,Co-IP捕獲目的蛋白和其互作蛋白,pull-down用融合標簽的重組蛋白來捕獲其互作蛋白。
2、如何區分蛋白表達在上清還是包涵體?
蛋白有可能表達在上清也可能表達在包涵體中,超聲碎菌之后,如果菌液比較清亮,沉淀比較少,那表達的蛋白基本是可溶的;如果超聲之后,菌液是渾濁的,而且在離心后沉淀比較多,且沉淀的顏色也比較白,蛋白基本就是在表達在包涵體中了。
3、如果蛋白表達在包涵體中是否可以進行后續GST pull down實驗?
包涵體,就是翻譯的蛋白沒有正確折疊而聚集在一起形成的,用高濃度的尿素和鹽酸胍可以使其變性,解聚后再嘗試。
八、案例分享
Mitophagy associated self-degradation of phosphorylated MAP4 guarantees the migration and proliferation responses of keratinocytes to hypoxia
期刊:cell death discovery
IF:7.109
發表時間:2023/5/17(文章中材料和方法提到金開瑞)
C The direct interaction of GST-LC3 and HIS-MAP4-1 (1–170 aa) measured by GST pull-down. n = 3. D The direct interaction of GST-LC3 and HISMAP4-2 (398–547 aa) detected by GST pull-down. n = 3. E, F The direct interaction of GST-LC3 with MAP4-1 Mut1△34,37 or MAP4-1 Mut2△47,50
detected by GST pull-down. n = 3.
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