一、細胞增殖實驗之CCK8實驗

01、實驗原理

    CCK-8試劑中含有WST–8，WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan（甲瓚，是一種顯色劑）。生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比。用酶標儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。

02、實驗流程

    1、將處理過的細胞胰酶消化后計數，接種1000個細胞至96孔板，每孔100μl培養基，將培養板置37℃，5% CO?培養箱中培養0 h、24h、48h和72h；

    2、每孔加入10μl CCK-8溶液，用加了相應量細胞培養液和CCK-8溶液但沒有加入細胞的孔作為空白對照；

    3、在細胞培養箱內繼續孵育0.5h，用酶標儀在450nm測定吸光度。

二、細胞增殖實驗之克隆形成實驗

01、實驗原理

    克隆形成實驗：克隆指單個細胞在體外持續分裂繁殖6代以上，其后代所組成的細胞群。光鏡下，大于50個細胞，計數為1克隆。克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。

    平皿克隆形成試驗：適用于貼壁細胞， 如正常細胞和腫瘤細胞；

    軟瓊脂克隆形成試驗：適用于腫瘤細胞、 轉化細胞和懸浮生長細胞；

    克隆形成率 =（克隆數/接種細胞數） × 100%

02、實驗流程

    1、取對數生長期的單層培養細胞，用0.05%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%FBS的培養基中備用；

    2、根據增殖能力將細胞以適當的密度接種于6孔板中，置37℃,5% CO? 培養箱中，靜置培養2～3周；

    3、經常觀察，當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養；

    4、棄去上清液，用PBS 小心清洗2次；

    5、加入4%PFA固定15min，棄去固定液；

    6、加適量結晶紫染色液染色10～30min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥；

    7、計數/Image J分析染色面積。

三、細胞增殖實驗應用延伸

01、有哪些檢測細胞增殖的方法？

    在細胞增殖檢測中，MTT、CCK-8和Colony Forming是常用的方法之一。它們都有各自的優勢和適用范圍，因此使用頻率相對較高。

    MTT測定和CCK-8測定是常用的間接評估細胞增殖活性的方法，特別適用于高通量篩選和快速獲得結果。它們在細胞代謝活性的評估方面比較方便，因此在許多實驗中被廣泛采用。

    Colony Forming實驗則被用于評估細胞的克隆生成能力和增殖能力，通過直接觀察和計數形成的細胞集落來推斷細胞增殖能力。這種方法在研究細胞增殖能力和克隆性方面更為直接，常用于細胞生物學和腫瘤學研究中。

    其他的細胞增殖檢測方法如BrdU標記、Ki-67免疫染色、流式細胞術和細胞計數等也在特定的研究領域和實驗中得到廣泛應用。

    總體而言，選擇使用哪種方法取決于研究的目的、細胞類型、實驗條件以及實驗室的偏好。不同的方法可以提供不同的信息和實驗結果，所以在設計實驗時需要綜合考慮各種因素。

02、細胞增殖檢測方法的介紹和優劣勢對比

四、案例分享

當涉及到細胞增殖檢測方法的使用時，一些常見的研究領域和實驗應用的示例：

01、腫瘤學研究

  ? MTT測定：評估腫瘤細胞系對抗腫瘤藥物的敏感性和抗藥性。

  ? Colony Forming：評估腫瘤干細胞的克隆生成能力和增殖能力。

  ? Ki-67免疫染色：檢測腫瘤組織中Ki-67的表達水平，評估腫瘤細胞的增殖活性。

02、藥物篩選和毒性研究

  ? CCK-8測定：進行高通量篩選，評估化合物對細胞增殖的影響。

  ? 流式細胞術：測定細胞周期分布，判斷藥物對細胞周期的影響。

  ? MTT測定：評估藥物或化合物的細胞毒性作用。

03、組織工程和再生醫學

  ? Colony Forming：評估干細胞的增殖和分化能力，用于組織工程和再生醫學研究。

  ? 細胞計數：計算細胞數量以確定組織工程支架的細胞種植密度。

04、免疫學研究

  ? BrdU標記：標記正在進行DNA復制的免疫細胞，評估免疫細胞增殖活性。

  ? Ki-67免疫染色：檢測免疫細胞中Ki-67的表達，評估其增殖能力和激活狀態。

這些只是一些示例，實際上在各個研究領域和實驗中可以使用不同的細胞增殖檢測方法。選擇合適的方法需要考慮研究問題、細胞類型和實驗條件等因素，并根據實驗目的進行決策。