RNA和蛋白質相互作用是指RNA分子與蛋白質分子之間的物理、化學或生物學相互作用。RNA可以通過與蛋白質相互作用來調控蛋白質的功能，而蛋白質也可以影響RNA的結構和穩定性。這種相互作用可以對細胞和生物體內的各種生物學過程產生重要影響，包括基因表達、蛋白質合成、細胞信號傳導等。

    RNA和蛋白質相互作用在許多疾病的發生和發展中發揮關鍵作用，深入了解這些相互作用可以幫助我們識別疾病的潛在機制，并尋找新的治療靶點。在藥物研發中，許多藥物是通過干擾特定的RNA-蛋白質相互作用來實現其治療效果的。因此，RNA和蛋白質相互作用的研究可用于分析基因表達、疾病標志物的檢測和藥物篩選等方面，幫助設計更有效的藥物。

    RIP、RNA pull-down和MeRIP等實驗技術是我們深入研究RNA和蛋白質相互作用的關鍵工具。RIP用于選擇性地富集與特定RNA相互作用的蛋白質，RNA pull-down通過RNA探針捕獲相互作用蛋白質，而MeRIP則用于甲基化RNA的研究。下面就讓我們詳細了解一下。

1、RIP

    RIP，全稱為RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 結合蛋白免疫沉淀，其主要目的是富集RNA分子和與之相互作用的蛋白質，以便進一步分析這些相互作用的性質和功能。

RIP的基本步驟如下：

    ① 交聯： 首先，將細胞或組織樣本進行交聯，通常使用交聯劑（如甲醛）處理，以穩定RNA和與之相互作用的蛋白質。

    ② 細胞裂解： 細胞或組織樣本被裂解，使RNA和蛋白質釋放到溶液中。

    ③ 免疫沉淀： 將特定抗體加入樣品中，這些抗體能夠識別并結合感興趣的蛋白質。這些抗體與目標蛋白質結合后，形成免疫復合物。

    ④ 沉淀： 使用蛋白質A/G磁珠或其他材料，將免疫復合物沉淀下來，同時將未結合的RNA和蛋白質分離。

    ⑤ 洗滌： 對沉淀下來的免疫復合物進行多次洗滌，以去除非特異性結合的雜質。

    ⑥ 去交聯： 通過加熱或酶處理，解除RNA和蛋白質之間的交聯，將它們釋放到溶液中。

    ⑦ RNA提取： 從免疫復合物中提取RNA，使其可以進行后續的分析，如逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、RNA測序或微陣列分析。

2、RNA pull-down

    RNA pull down的主要目的是通過特定的RNA分子（通常是已知的非編碼RNA或mRNA的片段）來富集與之相互作用的蛋白質，以便進一步研究這些相互作用的性質和功能。

RNA pull-down的基本步驟如下：

    ① RNA標記：首先，標記目標RNA分子（通常是合成的in vitro轉錄RNA），通常使用生物素（biotin）標記。這種標記的RNA片段可以被用作“魚餌”來捕獲與其相互作用的蛋白質。

    ② RNA與細胞提取物相互作用：標記的RNA片段被加入細胞或組織的提取物中，使其和與之相互作用的蛋白質結合形成RNA-蛋白質復合物。

    ③ 親和富集：標記的RNA片段及其相互作用的蛋白質復合物可以通過生物素和親和纖維素（如瓊脂糖瓊脂糖珠）的相互作用來富集。這種親和富集的步驟將RNA-蛋白質復合物從總提取物中分離出來。

    ④ 洗滌： 富集的RNA-蛋白質復合物被多次洗滌，以去除非特異性結合的蛋白質和其他污染物。

    ⑤ 蛋白質識別： 最后，富集的蛋白質可以通過質譜分析、Western blotting等技術來鑒定和分析。

3、MeRIP

    MeRIP，全稱為Methylated RNA Immunoprecipitation（RNA甲基化免疫沉淀），是一種用于研究RNA上的甲基化修飾以及與甲基化RNA相互作用的實驗技術。其主要目的是富集甲基化的RNA分子，并進一步分析這些RNA分子的甲基化模式以及與其相互作用的蛋白質。

MeRIP的基本步驟如下：

    ① RNA修飾： 首先，RNA樣本中的甲基化位點通常會通過堿基特異性甲基化酶進行修飾，將甲基添加到RNA分子的特定堿基上，如腺嘌呤（adenine）或胞嘧啶（cytosine）。

    ② RNA與甲基化抗體相互作用：修飾后的RNA與抗體（通常是特異性識別RNA甲基化的抗體）相互作用，形成RNA-抗體復合物。這些抗體能夠識別并結合甲基化的RNA分子。

    ③ 免疫沉淀：將免疫復合物通過蛋白質A/G磁珠或其他材料進行免疫沉淀，將富集甲基化的RNA與與之相互作用的蛋白質分離出來。

    ④ 洗滌：對免疫復合物進行多次洗滌，以去除非特異性結合的雜質。

    ⑤ RNA提取： 從免疫復合物中提取RNA，使其可以進行后續的分析，如逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、RNA測序或甲基化位點鑒定。

三種技術的對比分析如下：

    總的來說，RIP、RNA pull-down和MeRIP是用于研究RNA與蛋白質相互作用或RNA甲基化的重要實驗技術。它們各自適用于不同的研究場景，具有一定的優勢和局限性。選擇合適的技術取決于研究問題的具體需求和樣本類型。

案例分享

CircPVT1 promotes proliferation of lung squamous cell carcinoma by binding to miR-30d/e.

J Exp Clin Cancer Res.(IF=11.161)

    環狀RNA(circRNAs)是一類新型的廣泛存在的非編碼RNA，可以調控不同的人類疾病，包括癌癥的發生發展。然而，關于circRNAs在肺鱗狀細胞癌(LUSC)中的潛在機制和臨床意義的信息還很少。

    本研究使用RNA測序(RNA-seq)技術對8個LUSC組織和9個健康肺組織中的RNA表達譜進行了分析。qRT-PCR用于分析circPVT1的表達及其與LUSC預后（即生存分析）的關系。此外，進行了體外和體內實驗評估circPVT1對腫瘤生長的影響。進一步進行了RNA pull-down實驗、質譜分析、雙熒光素酶報告基因分析和RNA免疫沉淀實驗，以探究circPVT1、HuR或miR-30d/e在LUSC中的相互作用。

    我們的數據顯示，circPVT1在LUSC組織、血清和細胞系中上調。表達circPVT1較高的LUSC患者生存率較短。體內和體外數據顯示circPVT1促進LUSC細胞的增殖。此外，機制分析顯示HuR調控circPVT1。另一方面，circPVT1作為miR-30d和miR-30e的競爭性內源性RNA(ceRNA),在減輕miR-30d和miR-30e對其靶基因cyclin F(CCNF)的抑制影響方面發揮作用。

    綜上所述，circPVT1通過HuR/circPVT1/miR-30d和miR-30e/CCNF級聯通路促進LUSC進展。此外，它還作為LUSC診斷的新型生物標志物或治療靶點。

CircPVT1 is actively induced by HuR.a Silver staining of biotinylated circPVT1-associated proteins;b Western blotting of HuR from circPVT1 pull-down assays;c RIP confirmed the relationship between circPVT1 and HuR in H520 cells.GAPDH mRNA was used as a non-HuR target control.