人類疾病往往并非由容易追蹤的單一基因變異導致，大多數疾病例如心臟病、癌癥或者精神疾病都源自許多不同基因與彼此以及環境之間的復雜互動。分子互作研究（核酸與核酸、核酸與蛋白、蛋白與蛋白）是疾病機制研究的重要組成部分，是功能、表型研究的進一步深化。

    蛋白質是生命體的重要組成部分，是生命活動的主要承擔者和執行者。據估計，超過80%的蛋白質并不是孤立存在，而是與其他蛋白質通過相互作用形成穩定或瞬時的復合物結構。蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interactions，PPIs）是分子生物學中最重要的現象之一，幾乎在所有的生命過程中（如細胞通訊、代謝、轉運、信號轉導、免疫應答和基因轉錄）都起著核心作用。因此，對蛋白質-蛋白質相互作用的研究，已成為生命科學研究的熱點之一。

    研究蛋白質-蛋白質相互作用的常用實驗技術包括GST pull down、Co-IP和酵?雙雜交等，在之前的文章中已經對GST pull down和酵?雙雜交進行了深入講解，幫助大家更好地理解和運用這些技術手段。

 

一、Co-IP

1、技術原理

    免疫共沉淀是利?抗體特異性反應純化富集?的蛋?的?種?法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋?結合后，再與蛋?A/G（ProteinA/G）偶聯的Agarose或Sepharose珠?孵育，通過離?得到珠?-蛋?A/G-抗體-?的蛋?復合物（若?MagBeads則通過磁?分離得到珠?-蛋?A/G-抗體-?的蛋?復合物），在?溫及還原劑的作?下，抗原與抗體解離，收集上清，上清中包括抗體、?的蛋?和少量的雜蛋?。

 

2、技術流程

 

3、常?問題與解析

    Q1：通過Co-IP后WB驗證發現，沒有想要的?的條帶？

    A1：1）有可能是樣品被蛋?酶降解，對應的策略是需要添加蛋?酶抑制劑，所有操作保持4℃以下冰上操作并防?凍融。

           2）有可能是抗體濃度太低導致條帶較淺，則需要調整IP或WB抗體濃度，必要時設?濃度梯度，摸索最佳濃度。

           3）抗體親和?太低，選?適合于IP或者WB的抗體。

           4）有的IP抗體未與磁珠結合，這種情況需選?適合IP的磁珠。

           5）若Tag未暴露在融合蛋?構象的表?，則需改變Tag融合表達部位。

           6）裂解液鹽堿度太?，需?低鹽堿度的裂解液。

           7）抗體選擇不當，更換抗體。

    Q2：通過Co-IP后WB驗證發現，雖然可??的條帶，但是背景很?，原因是什么？

    A2：是由多方面原因造成的：

        1）由于?特異蛋?結合導致背景?，若要避??特異性蛋?結合，則需要在??清溶液中裂解細胞，且在免疫沉淀前?protein(A/G)珠?預洗，在免疫沉淀后增加漂洗次數和鹽堿度(?鹽或去垢劑)。

        2）實驗儀器或試劑被污染，使?潔凈的儀器及試劑。

        3）轉移膜上的?特異吸附導致背景?，實驗操作過程中戴?套，使?鑷?來取，不要接觸膜轉移?。

        4）制備樣品中可能有不完全溶解的?的蛋?復合體，則在制備樣品后進?短暫超聲處理(3次，每次5秒鐘)，然后離?，取上清后進?后續試驗。

        5）洗滌不徹底，則需要多次洗滌，并增加洗滌液中的NaCl和去垢劑濃度。

        6）可能有?特異性蛋?吸附于珠?上，則須進?Preclearing以排?特異性吸附。

        7）抗體本?待異性不好可能導致背景?，則須選擇合適的抗體，可以考慮單抗。

        8）使?了過多的細胞或組織進?裂解導致背景?，則須減少樣本量，推薦100-500μg細胞裂解液。

        9）蛋?降解也可能出現?背景的情況，盡量使?新鮮制備的樣品。

    蛋白質和核酸是組成生命的主要生物大分子，它們各自具有其結構特征和特定功能。核酸具有傳遞遺傳信息等功能，而蛋白質則貫穿生命的所有生理過程。

 

蛋白質-核酸相互作用

    生命科學是20世紀最重要的前沿研究領域之一，其重點在于了解各種生命活性物質的結構、功能及它們間的相互關系。蛋白質和核酸是組成生命的主要生物大分子，它們各自具有其結構特征和特定功能。核酸具有傳遞遺傳信息等功能，而蛋白質則貫穿生命的所有生理過程。宏觀上，兩者的配合與作用構成諸如生長、繁殖、運動、遺傳和代謝等生命現象的基礎，其中涉及蛋白質-RNA相互作用的代謝過程主要包括RNA分子的轉錄、前體RNA的轉錄后處理、RNA在細胞內的轉運與定位以及細胞內RNA的穩定化過程；涉及蛋白質-DNA相互作用主要包括基因的轉錄和調控、DNA的復制和修復、DNA的重組和包裝以及染色質和核糖體的形成等。

    研究蛋白質-RNA相互作用的常用實驗技術包括RNA pull down和RNA 結合蛋?免疫沉淀（RIP），研究蛋白質-DNA相互作用則常使用電泳遷移率檢測(EMSA)、染色質免疫共沉淀(ChlP)和DNA pull down技術。本期小編將以RIP和ChlP技術為例進行詳細介紹。

 

二、RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）

1、技術原理

    RNA 結合蛋?免疫沉淀（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RIP）主要是運?針對?標蛋?的抗體把相應的RNA-蛋?復合物沉淀下來，然后經過分離純化就可以對結合在復合物上的RNA進?q-PCR驗證或者測序分析。

 

2、技術流程

 

3、常?問題與解析

    Q1：如何判斷RIP實驗成功？

    A1：RIP后WB檢測IP組和input組檢測到?的蛋?信號即判斷RIP實驗成功。

    Q2：IP和IgG樣本Ct值沒有差異

    A2：多方面原因造成：

            1）抗體沒有富集到RNA，可更換抗體嘗試；

            2）IgG背景過?，可增加洗滌次數或減少免疫沉淀步驟RNA投?量。

    Q3：溶解曲線異常

    A3：出現?特異擴增或有引物?聚體等情況，需重新設計引物。

    Q4：拉下樣本RNA濃度過低

    A4：1）樣本投?量過少，考慮增加樣本初始投?量；

            ??????2）裂解不完全，組織樣本未研磨充分，或者?強裂解液進?裂解。

 

三、染色質免疫共沉淀技術（ChIP）

1、技術原理

    染?體免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是?來研究蛋白質與DNA是否在體內存在相互作用，這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某?特定位置會出現何種組蛋?修飾。利?抗體抗原特異性結合，將與目的蛋?相結合的DNA?段沉淀下來，能夠真實地反映結合在DNA序列上的調控蛋?。

 

2、技術流程

 

3、常?問題與解析

    Q1：怎么探索超聲條件

    A1：接觸式超聲儀：取1.5mL/2mL EP管，加?1.2mL液體，將探頭置于EP管中?，液?下約?半的位置，設置超聲時間為10S，逐漸增加功率，直?開始起泡，此時功率為超聲最?功率。在此基礎上設置三個不同的功率梯度和時間梯度進?探索。?接觸式：可按?家推薦進?探索。

    Q2：超聲后?段不符合要求

    A2：1）有符合要求的?段也有?較集中?法超聲的??段，可能是交聯溫度過?，交聯時始終保持溫度低于25℃，尤其是夏天溫度較?可將試劑和樣本放置空調出???段時間再進?操作；

            2）?段很集中且?于200bp，超聲功率和時間不合適，需要做預實驗探索最佳超聲條件。

    Q3：IP和IgG樣本Ct值沒有差異

    A3：多??原因造成:

            1）抗體沒有富集到DNA，可更換抗體嘗試；

            2）IgG背景過?，可增加洗滌次數或減少免疫沉淀步驟DNA投?量；

            3）結合位點預測錯誤，需重新設計引物。

    Q4：溶解曲線異常

    A4：出現?特異擴增或有引物?聚體等情況，需重新設計引物。

    Q5：樣本DNA濃度很低，低于10ng/μL

    A4：1）樣本投?量過少：考慮增加樣本初始投?量，尤其是肌?，?臟等；

            2）裂解不完全：過度交聯的樣本或組織研磨不充分。如遇難裂解的細菌樣本可在加?Lysis Buffer后-80℃反復凍融3次。

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