凝膠遷移或電泳遷移率實驗(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一種研究蛋白與核酸（包括DNA和RNA）相互結合的技術，可用于定性或定量分析。蛋白質可以與生物素標記的核酸探針結合，電泳時這種復合物比無蛋白結合的探針在凝膠中泳動的速度慢，即表現為相對滯后。

 

 一、EMSA的類型 

01、驗證型EMSA

    用于驗證探針是否含有可與蛋白質結合的位點。將結合位點突變，以突變探針為對照，野生型探針出現遷移條帶，而突變探針未出現遷移條帶，則說明該探針含有可與蛋白質結合的位點。

 

02、競爭型EMSA

    探針序列不變，不含修飾基團的探針稱為冷探針。冷探針與標記探針競爭性地與蛋白結合，冷探針不顯影出遷移條帶。以冷探針為對照，標記探針出現遷移條帶，而冷探針遷移條帶減弱或消失，則排除了假陽性干擾，增加實驗結果準確性。

 

03、超遷移EMSA

使用目標蛋白的特異性抗體，蛋白-探針復合物被抗體識別井結合，該三聚復合物在凝膠電泳中，遷移速率再次增大，出現在蛋白探針復合物的上方的超遷移條帶，驗證了探針與目的蛋白的特異性結合。
 

 二、EMSA的實驗步驟 

01、準備探針

    ●合成或購買與目標DNA或RNA片段互補的探針。

    ●標記DNA或RNA探針，通常使用生物素標記或熒光染料進行標記。

 

02、提取和純化蛋白

    ●從細胞或組織中提取目標蛋白。

    ●對蛋白進行純化和濃縮。

 

03、準備反應體系

    ●將標記的DNA或RNA探針與提取的蛋白混合，形成蛋白-核酸復合物。

    ●添加適當的緩沖液、非特異性競爭物質（例如非標記的DNA片段）和/或抗體（用于超遷移抑制實驗）。

 

04、電泳分析

    ●將蛋白-核酸復合物加載到聚丙烯酰胺凝膠上。

    ●在電場中進行電泳，使復合物根據大小和電荷遷移。

    ●分析電泳結果，觀察是否有新的、遷移速度變慢的帶，這些帶表示形成了蛋白-核酸復合物。

 

05、蛋白-核酸相互作用的確認

    ●可以進行超遷移抑制實驗，即加入抗體或競爭物質，觀察是否能夠改變或消失特定帶。

    ●可以進行多樣性實驗，例如逐步增加蛋白量，以觀察遷移帶的變化。

    請注意，具體的實驗步驟可能因實驗設計和所用試劑的不同而有所變化，因此在進行實驗前請參考相關文獻或廠家操作手冊。

 

 三、EMSA的應用 

    EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay）是一種常用的實驗技術，用于研究蛋白質與核酸之間的相互作用。它在許多研究領域中得到廣泛應用，包括但不限于以下幾個方面：

    ● 轉錄因子研究：EMSA可用于研究轉錄因子與DNA的結合。通過分析轉錄因子與特定基因啟動子或調控元件的結合能力，可以揭示基因調控網絡和轉錄調控機制。

    ● RNA結合蛋白研究：EMSA可用于研究RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）與RNA的相互作用。通過探究RBPs與目標RNA序列的結合，可以了解RBPs在轉錄后調控、RNA穩定性和翻譯調控等過程中的功能。

    ● DNA修復和損傷識別：EMSA可用于研究DNA修復酶和損傷識別蛋白與DNA損傷位點的結合。通過分析這些相互作用，可以深入了解DNA修復機制和DNA損傷應答通路。

    ● 藥物篩選和藥物靶點研究：EMSA可用于篩選和評估潛在藥物分子與特定DNA或RNA序列的結合能力。通過檢測藥物與靶點的相互作用，可以評估藥物的親和力和選擇性，為藥物開發和靶向治療提供重要信息。

    ● 基因調控網絡研究：EMSA可用于研究基因調控網絡中的轉錄因子與調控元件之間的相互作用。通過分析轉錄因子與特定啟動子或增強子序列的結合，可以揭示基因調控網絡的結構和功能，以及轉錄因子在調控基因表達中的作用。

    ● 疾病相關基因的功能研究：EMSA可用于研究與疾病相關的基因的功能調控。通過分析疾病相關基因的啟動子、增強子或調控元件與轉錄因子的結合，可以了解這些基因的調控機制和與疾病相關的功能變化。

 

 四、EMSA實驗中常見問題及解析 

    01、模糊的帶和多條帶：遷移時出現模糊的帶或多條帶，使結果難以解釋。

    解決方法：

    ● 檢查電泳條件，確保電場強度和運行時間適中。

    ● 調整凝膠濃度，以獲得更好的分辨率。

    ● 可能需要優化核酸探針或蛋白的濃度，以獲得清晰的帶。

 

    02、沒有帶：沒有觀察到蛋白-核酸復合物的遷移帶。

    解決方法：

    ● 檢查是否添加了足夠的蛋白或核酸樣本。

    ● 確保實驗條件（如緩沖液、溫度等）適合特定的蛋白-核酸相互作用。

    ● 可能需要優化反應條件，如延長孵育時間。

 

    03、非特異性結合：蛋白可能非特異性地結合到核酸上，而不是與感興趣的序列結合。

    解決方法：

    ● 使用比賽實驗，添加過量的非標的核酸，以驗證觀察到的遷移是否是特異性的。

    ● 可能需要優化反應條件或嘗試更嚴格的條件以增加特異性。

 

    04、蛋白沉淀不完全：有時，不是所有的蛋白都與核酸結合或從凝膠中轉移。

    解決方法：

    ● 確保反應時間足夠長，以確保完全的結合。

    ● 使用更高的核酸或蛋白濃度，以提高復合物形成的機會。

    ● 考慮改變緩沖液和離心的條件以改善復合物的沉淀。

 

    05、核酸或蛋白質質量差：使用的核酸或蛋白質可能不夠純凈，影響實驗結果。

    解決方法：

    ● 確保使用高質量的核酸和蛋白質。

    ● 進行額外的純化步驟，如凈化柱或凝膠電泳。