GST pull-down實驗流程及應用
GST pull-down實驗基于GST(glutathione-S-transferase),即谷胱甘肽-S-轉移酶蛋白,可以與谷胱甘肽(Glutathione,GSH)結合,將GSH固定于磁珠上,形成GSH-磁珠,將已知蛋白X與GST融合表達,獲得的GST-X蛋白可與GSH-磁珠結合,若體系中存在與X蛋白互做的蛋白Y,則會形成“磁珠-GSH-GST-X-Y”復合物,與X蛋白互做的蛋白即可被分離并檢測。
一、技術優勢
● 在樣本無IP級別抗體,且不能做標簽抗體驗證時首選,尤其是研究植物方向客戶;
● 可以驗證兩個蛋白是否為直接互作;
● 可以與Co-IP或酵母雙雜交共同驗證一個問題;
● ......
二、技術應用
● 蛋白質相互作用研究:GST pull-down可用于研究蛋白質間的相互作用,幫助揭示蛋白質互作網絡和信號傳導途徑。通過將目標蛋白質與GST融合,可以通過GST pull-down實驗來尋找與其相互作用的蛋白質。
● 信號轉導研究:GST pull-down可用于研究信號轉導通路中的蛋白質相互作用,例如研究激酶與底物之間的相互作用、信號傳導復合物的組裝等。
● 蛋白質結構和功能研究:GST pull-down可以用于確定蛋白質結構域的結合伙伴,幫助研究蛋白質的功能和結構-功能關系。
● 細胞周期和細胞凋亡研究:GST pull-down可以用于研究細胞周期調控蛋白、凋亡相關蛋白以及相關信號通路中的蛋白質相互作用。
● 藥物研發和篩選:GST pull-down可以用于篩選潛在的藥物靶點和藥物分子與目標蛋白質的相互作用。
● 癌癥研究:GST pull-down在癌癥相關蛋白質相互作用的研究中也有廣泛應用,有助于揭示癌癥發展和治療靶點。
總體而言,GST pull-down技術在蛋白質相互作用研究、信號轉導、蛋白質結構和功能研究以及藥物研發等領域中發揮著重要作用,為研究人員提供了一種有效的工具來探索蛋白質間的相互作用和功能。
三、實驗流程
(1)蛋白提取與蛋白濃度測定;
(2)pull down前WB檢測誘餌蛋白及獵物蛋白的表達;
(3)pull down實驗,包括以下步驟:
a.磁珠準備,將磁珠分裝且標記為實驗組和對照組,用預冷的IP洗滌液重懸磁珠;
b.磁珠結合誘餌蛋白GST-A(實驗組加誘餌蛋白GST-A,對照組加標簽GST蛋白),靜音混合2h后用預冷的IP洗滌液進行洗滌重懸磁珠;
c.誘餌蛋白結合互作蛋白His-B(實驗組合對照組分別加入His-B或總蛋白),4℃靜音混合過夜(約16h)后用預冷的IP洗滌液進行洗滌重懸磁珠;
d.洗脫;
(4)pull down后WB檢測或者MS檢測。
四、常見問題與解析
1、IP、Co-IP、pull-down的區別?
通常IP或Co-IP使用組織細胞材料,靶蛋白為內源天然蛋白或組織細胞中過表達蛋白(可融合標簽)。Pull-down中的誘餌蛋白一般經重組表達獲得。IP和Co-IP需要使用親和力好的一抗,選購時需注意相應驗證數據。
簡單來說,IP捕獲目的蛋白,Co-IP捕獲目的蛋白和其互作蛋白,pull-down用融合標簽的重組蛋白來捕獲其互作蛋白。
2、我的GST pull-down實驗結果含有大量背景信號,怎么辦?
背景信號可能來自于非特異性結合。您可以嘗試增加洗脫步驟次數、使用更嚴格的洗脫條件,或者添加更多的非特異性結合抑制劑,如BSA。
3、我的GST pull-down實驗得到的蛋白帶模糊不清,怎么提高分辨率?
這可能是由于洗脫條件不足或者蛋白純度不高引起的。您可以增加洗脫液中洗脫劑的濃度,提高純度,或者考慮使用其他柱層析方法提純蛋白。
4、如何區分蛋白表達在上清還是包涵體?
蛋白有可能表達在上清也可能表達在包涵體中,超聲碎菌之后,如果菌液比較清亮,沉淀比較少,那表達的蛋白基本是可溶的;如果超聲之后,菌液是渾濁的,而且在離心后沉淀比較多,且沉淀的顏色也比較白,蛋白基本就是在表達在包涵體中了。
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