Shank3 是一種與自閉癥發(fā)展和惡化相關(guān)的關(guān)鍵分子，最近發(fā)現(xiàn)在小鼠缺血/再灌注 (I/R) 后腦組織中的表達(dá)下調(diào)。然而，其對I/R后神經(jīng)元損傷的影響及作用機(jī)制仍有待闡明。研究者發(fā)現(xiàn)Shank3在I/R后的表達(dá)呈時間依賴性變化。而條件性敲除（cko）Shank3會導(dǎo)致神經(jīng)元損傷加重。進(jìn)一步研究揭示，Shank3在I/R后通過直接與STIM1結(jié)合，促使STIM1經(jīng)蛋白酶體介導(dǎo)降解，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激和炎癥傷害的作用。STIM1的下調(diào)能夠增加下游Nrf2的磷酸化水平，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，促進(jìn)抗氧化基因NQO1和HO-1等表達(dá)。體內(nèi)研究表明，STIM1的敲除減輕了I/R后Shank3^cko小鼠的氧化應(yīng)激和炎癥。總體而言，本研究揭示了Shank3與STIM1相互作用，并通過Nrf2途徑抑制I/R后神經(jīng)元的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，為潛在的I/R治療方法的發(fā)展提供了理論支持。

 研究結(jié)果 

01、Shank3在體內(nèi)和體外缺血/再灌注（I/R）損傷后呈現(xiàn)出時間依賴性的調(diào)節(jié)

    為模擬體內(nèi)中風(fēng)后的I/R損傷，小鼠進(jìn)行tMCAO 1小時后再灌注。據(jù)報道，在嚙齒類動物大腦中，海馬體對I/R損傷相當(dāng)敏感，因此我們重點關(guān)注了海馬體的Shank3表達(dá)。海馬體Shank3的表達(dá)在缺血和再灌注過程中表現(xiàn)出時間依賴性變化。Shank3在缺血后下降，再灌注期間開始上升，并在6小時達(dá)到峰值，之后下降。海馬體Shank3的免疫熒光染色表明，與Sham組相比，缺血和I/R組中的Shank3顯著下調(diào)。此外，氧和葡萄糖剝奪（OGD）也導(dǎo)致HT22細(xì)胞中Shank3表達(dá)下降，再灌注后有所上升，但仍低于標(biāo)準(zhǔn)條件。這些結(jié)果表明I/R導(dǎo)致Shank3在體內(nèi)和體外呈現(xiàn)出時間依賴性的波動，也暗示著Shank3在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。

圖1. Shank3在腦缺血再灌注損傷中的時空表達(dá)

    A：小鼠海馬體Shank3蛋白水平在I/R過程中的變化。B：Shank3的相對表達(dá)量隨I/R時間而改變。C：Shank3的mRNA水平在I/R后發(fā)生變化。D：Shank3在海馬體的定位和表達(dá)。E：Shank3的染色強(qiáng)度在I/R后發(fā)生變化。F：HT22細(xì)胞中Shank3蛋白水平在OGD和再灌注后的變化。G：Shank3的相對表達(dá)量在OGD/R處理后發(fā)生變化。H：Shank3的mRNA水平在OGD/R處理后發(fā)生變化。I：Shank3在HT22細(xì)胞的定位和表達(dá)。J：Shank3的染色強(qiáng)度在OGD/R處理后發(fā)生變化。

02、神經(jīng)元特異性Shank3敲除通過促進(jìn)神經(jīng)元凋亡加重I/R后的腦損傷

    為了深入探究Shank3在I/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中的作用，研究者利用Cre-LoxP重組技術(shù)構(gòu)建了神經(jīng)元特異性的Shank3敲除小鼠（Shank3^cko），并驗證了敲除效率。盡管Shank3^cko小鼠表現(xiàn)出部分神經(jīng)功能缺損，但Sham手術(shù)影響有限。與對照組相比，Shank3^cko小鼠在I/R后表現(xiàn)出更嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損、腦水腫和更高的梗死體積比。Western blot和免疫熒光實驗結(jié)果顯示，Shank3敲除后，抗凋亡標(biāo)記物Bcl-2/Bax比值降低，而凋亡標(biāo)記物cleaved-caspase3增加。Shank3敲除增加了I/R后海馬體中TUNEL陽性細(xì)胞的數(shù)量。這些結(jié)果表明，神經(jīng)元中Shank3的敲除加重了I/R后的腦損傷，并通過促進(jìn)神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致神經(jīng)功能惡化。

圖2. Shank3敲除加劇缺血性腦損傷

    A：構(gòu)建Shank3的條件性敲除小鼠。B, C：I/R后，Shank3敲除小鼠的Clark評分顯著高于對照組，顯示總體和局灶性神經(jīng)功能缺損。D：腦水腫程度在Shank3敲除小鼠中加重。E, F：TTC染色顯示Shank3敲除小鼠的大腦梗死區(qū)域更大。G-I：Western blot分析顯示Shank3敲除后，凋亡標(biāo)記物增加，抗凋亡標(biāo)記物減少。J：海馬體的共聚焦圖像顯示在Shank3敲除小鼠中更多的TUNEL陽性細(xì)胞（凋亡細(xì)胞）。K：TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量在Shank3敲除小鼠中顯著增加。

03、Shank3的缺失加劇體內(nèi)I/R后的氧化應(yīng)激和炎癥

    本研究探討了Shank3對氧化應(yīng)激和炎癥的影響，考慮到氧化應(yīng)激和炎癥在I/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中的作用。與Sham組相比，Shank3f/f小鼠大腦中ROS和丙二醛（MDA）等脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的水平在I/R后顯著增加，而Shank3敲除則進(jìn)一步加劇了這一現(xiàn)象。另一方面，抗氧化劑如GSH-Px、GSH、CAT和SOD的水平在Shank3敲除后顯著降低。此外，條件性敲除Shank3后，促炎細(xì)胞因子TNF、IL-1β和IL-6也顯著增加。血清中細(xì)胞因子水平的測量顯示，Shank3敲除與組織中的變化趨勢相似。綜上所述，敲除Shank3加劇了I/R后體內(nèi)海馬體神經(jīng)元的氧化應(yīng)激和炎癥。

圖3. Shank3的缺失加重I/R后的氧化應(yīng)激和炎癥

    A-I：收集I/R后的海馬體組織并勻漿，以測定ROS、MDA、GSH-Px、GSH、SOD、CAT、TNF、IL-1β和IL-6的水平。

04、Shank3在體外抑制OGD/R后的細(xì)胞凋亡、ROS產(chǎn)生和炎癥

    為了闡明Shank3對缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，在HT22細(xì)胞中，通過shRNA敲低和慢病毒過表達(dá)Shank3，然后進(jìn)行OGD/R處理。與體內(nèi)實驗結(jié)果一致，Shank3的缺乏增加了凋亡蛋白cleaved-caspase3，降低了Bcl-2/Bax比率和細(xì)胞活力，通過TUNEL染色也觀察到細(xì)胞凋亡的增加。此外，敲低Shank3顯著增加了ROS和MDA，并降低了抗氧化劑GSH-Px、GSH和SOD的產(chǎn)生。OGD/R處理后，HT22細(xì)胞中TNF、IL-1β和IL-6等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)增加，由于Shank3的缺乏，其表達(dá)進(jìn)一步顯著增加。這些由OGD/R和Shank3敲低引起的有害效應(yīng)部分可以通過Shank3過表達(dá)得到逆轉(zhuǎn)。總的來說，這些結(jié)果表明Shank3對OGD/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥具有保護(hù)作用。

圖4. 敲低Shank3對OGD/R后HT22細(xì)胞中細(xì)胞毒性和凋亡的影響

    A-C: Shank3對Bcl-2/Bax和cleaved-caspase3的影響。D和E: TUNEL染色顯示凋亡細(xì)胞的數(shù)量。F: Shank3提高HT22細(xì)胞的存活率。G和H: Shank3降低ROS的產(chǎn)生。通過熒光染色觀察并量化ROS水平，顯示Shank3能抑制I/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。I-O: Shank3對氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。結(jié)果顯示Shank3降低MDA（氧化應(yīng)激標(biāo)志物）、提高抗氧化酶（如GSH-Px、GSH和SOD）的表達(dá)，并降低炎癥因子（如TNF、IL-1β和IL-6）的表達(dá)。

05、Shank3與神經(jīng)元中的STIM1直接相互作用

    通過對Shank3^cko和Shank3f/f小鼠海馬體進(jìn)行RNA-Seq分析，揭示了Shank3對下游信號傳導(dǎo)的影響。GO分析顯示，與鈣離子結(jié)合相關(guān)的基因表達(dá)得到富集。GSEA表明，負(fù)調(diào)控細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度的基因集發(fā)生了顯著變化。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)STIM1的表達(dá)增加與神經(jīng)氧化損傷和細(xì)胞凋亡相關(guān)，而抑制STIM1緩解了鈣超載介導(dǎo)的神經(jīng)損傷。通過分子對接實驗，確定了Shank3的ANK結(jié)構(gòu)域與STIM1的SOAR結(jié)構(gòu)域之間的直接相互作用。免疫熒光實驗證明Shank3和STIM1主要共定位在海馬體神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。免疫共沉淀和GST pull-down實驗證實了它們之間的蛋白質(zhì)相互作用，敲除ANK結(jié)構(gòu)域預(yù)測的結(jié)合位點導(dǎo)致相互作用減弱。Shank3過表達(dá)降低STIM1水平，而Shank3敲除增加STIM1表達(dá)，表明Shank3對STIM1的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。此外，Shank3通過泛素-蛋白酶體途徑降解STIM1。這些結(jié)果表明，Shank3通過調(diào)節(jié)STIM1穩(wěn)定性，發(fā)揮對I/R后神經(jīng)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，減少鈣離子內(nèi)流。

圖5. Shank3對STIM1的調(diào)節(jié)作用

    A、B: Shank3的ANK結(jié)構(gòu)域與STIM1的SOAR結(jié)構(gòu)域的結(jié)合概覽。C、D: Shank3與STIM1結(jié)合模式的二維和三維預(yù)測分析。E: Shank3（綠）和STIM1（紅）在海馬體的熒光染色。F: 通過Co-IP實驗證明了Shank3與STIM1之間的蛋白質(zhì)相互作用。G: GST pull-down實驗顯示Shank3直接與STIM1結(jié)合。H、I: Shank3突變體顯著減弱了Shank3與STIM1之間的蛋白質(zhì)相互作用。J、K: HT22細(xì)胞中Shank3和STIM1的蛋白水平。L、M: Shank3敲低后STIM1的泛素化水平變化。

文中的GST pull-down檢測由金開瑞合作完成

06、Shank3通過下調(diào)STIM1表達(dá)緩解了OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷

    作者進(jìn)一步探究了Shank3對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的保護(hù)作用是否依賴于STIM1。降低STIM1表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了Shank3敲除后OGD/R引起的Bcl-2/Bax比值下降和cleaved-caspase3表達(dá)上調(diào)。TUNEL染色和CCK-8實驗證明，在STIM1和Shank3雙敲除組中，相比于Shank3敲除組，細(xì)胞凋亡減少，存活率增加。這些結(jié)果表明，Shank3通過下調(diào)STIM1在體外減輕了OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

圖6. STIM1的下調(diào)減輕了Shank3敲低后OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

    A-E: 在OGD/R后通過沉默STIM1影響Shank3敲除細(xì)胞中Shank3、STIM1、Bcl-2/Bax和cleaved-caspase3表達(dá)水平的變化。F、G: STIM1沉默對OGD/R后細(xì)胞凋亡的影響。H: STIM1沉默對細(xì)胞活力的影響。

07、Shank3/STIM1相互作用通過Nrf2磷酸化和核轉(zhuǎn)位在OGD/R后發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用

    研究發(fā)現(xiàn)Shank3與STIM1的相互作用通過Nrf2途徑對氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)產(chǎn)生保護(hù)作用。與shNC組相比，敲低Shank3增強(qiáng)了HT22細(xì)胞在OGD/R后的鈣離子流入，而這一現(xiàn)象在STIM1沉默后得到顯著逆轉(zhuǎn)。鈣離子流入增加導(dǎo)致calcineurin表達(dá)增加和Nrf2去磷酸化。Nrf2磷酸化減少抑制了Nrf2的核轉(zhuǎn)位，從而減少了下游靶基因如NQO-1和HO-1的表達(dá)。然而，STIM1沉默逆轉(zhuǎn)了Shank3缺陷對各種氧化劑/抗氧化分子的調(diào)節(jié)作用，包括ROS、MDA、SOD、GSH-Px、GSH和SOD，以及促炎細(xì)胞因子TNF、IL-1β和IL-6的升高。這些結(jié)果表明，Shank3/STIM1相互作用對OGD/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥活動的保護(hù)作用依賴于Nrf2的磷酸化和核轉(zhuǎn)位。

圖7. Shank3/STIM1/Nrf2信號通路參與了OGD/R后Nrf2核轉(zhuǎn)位和抗氧化應(yīng)激活性

    A-F：在經(jīng)過OGD/R處理的細(xì)胞中通過Western blot分析Nrf2、calcineurin、p-Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白水平。G、H：ROS水平的熒光染色圖像和定量分析。I-L：對包括MDA、GSH-Px、GSH和SOD在內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)的分析。M-O：敲低STIM1對TNF、IL-1β和IL-6的影響。

08、敲低STIM1保護(hù)Shank3^cko小鼠免受I/R誘導(dǎo)的腦損傷

    為了研究Shank3/STIM1相互作用在腦缺血再灌注損傷中的作用，研究者對Shank3^cko小鼠進(jìn)行AAV9-STIM1-sgRNA或空載體病毒的注射，并進(jìn)行tMCAO/R。STIM1沉默顯著減輕了Shank3^cko小鼠I/R后的腦損傷，包括梗死體積和腦水腫的減少。STIM1的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了Shank3缺失引起的細(xì)胞凋亡，提高了Bcl-2/Bax比值，降低了cleaved-caspase3水平和TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。同時，STIM1缺陷小鼠的ROS、MDA和炎癥細(xì)胞因子水平下降，而抗氧化酶GSH-Px和SOD增加。總之，Shank3與STIM1的相互作用在I/R后對抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中具有保護(hù)作用。 

圖8. 敲低STIM1緩解Shank3缺乏引起的缺血再灌注腦損傷

    A、B：缺血再灌注后，Shank3缺乏的小鼠表現(xiàn)出明顯的腦損傷，而敲低STIM1顯著緩解了這種損傷。C、D：與對照組相比，Shank3缺乏的小鼠在缺血再灌注后梗死體積顯著增加，而敲低STIM1減小了梗死體積。E-G：敲低STIM1增加了Bcl-2/Bax的比率，降低了cleaved-caspase3的水平，從而抑制了細(xì)胞凋亡。H、I：敲低STIM1顯著減少了缺血再灌注后海馬體的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量。J-P：敲低STIM1降低了氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)的水平，具有抗炎和抗氧化作用。

 總結(jié) 

    總之，本研究確定了Shank3在I/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元氧化應(yīng)激和炎癥中的作用，并揭示了Shank3/STIM1/Nrf2通路在其中發(fā)揮作用的機(jī)制，從而為I/R提供了一種有前景的治療策略。

    參考文獻(xiàn)：https://doi.org/10.1016/j.redox.2023.102983