長期以來，人們一直認為一碳代謝（OCM）與阿爾茨海默病（AD）相關，但潛在的機制仍然不明確。利用化學生物學的優勢，作者發現線粒體絲氨酸羥甲基轉移酶2（SHMT2）直接調節ADAM金屬蛋白酶結構域10（ADAM10）的翻譯，后者是AD的治療靶點。發現小分子Kenpaullone（KEN）通過5'UTR促進ADAM10的翻譯，并改善APP/PS1小鼠的認知功能。SHMT2作為KEN的靶基因和5'UTR相互作用的RNA結合蛋白（RBP）介導了KEN誘導的ADAM10在體內外的翻譯。SHMT2通過與大量RNA結合控制AD信號通路，并通過與GAGGG基序直接相互作用增強ADAM10的5'UTR活性，而這個基序影響了5'UTR中的核糖體掃描。綜上所述，KEN通過將OCM與RNA處理聯系起來，展現了治療AD的潛力，在這一過程中，代謝酶SHMT2通過結合GAGGG基序并促進5'UTR依賴的ADAM10翻譯起始，起到了“雙重身份”的作用。

研究方法與結果

  01、KEN增加了人類和小鼠細胞中的ADAM10表達

    KEN已被證實可調節線粒體中parkin的招募，預防聽力損失，并增加神經元分化，延長運動神經元的健康壽命。雖然這種分子似乎具有抗癌活性，但在神經退行性疾病中也具有抗凋亡作用。作者首先在SH-SY5Y細胞中測量了ADAM10蛋白水平，發現KEN在0.5至2μM濃度下顯著增加了m-ADAM10的表達。進一步研究顯示，這種效應不是由于KEN抑制CDKs和GSK-3引起的。而且，KEN還在人類和小鼠細胞中增強了ADAM10蛋白水平，且不引起明顯細胞毒性。免疫熒光圖像顯示，KEN顯著增加了SH-SY5Y細胞中ADAM10蛋白的表達水平。此外，KEN還使Aβ42水平顯著降低，表明KEN增強的ADAM10在Aβ的產生中具有功能作用。

圖1: Kenpaullone（KEN）增加了人類和小鼠細胞中的ADAM10蛋白水平

  02、KEN介導的ADAM10增強依賴于5'UTR

    KEN導致ADAM10增強可能是由于轉錄、翻譯或蛋白質降解的改變，因此作者首先在SH-SY5Y細胞中測量了mRNA水平。如圖2A所示，KEN并未改變ADAM10 mRNA水平。轉錄抑制劑放線菌素D（ActD）或蛋白質合成抑制劑環己亞胺（CHX）單獨導致ADAM10蛋白水平降低，而KEN誘導的ADAM10增強在CHX存在時減弱，但在ActD存在時沒有減弱（圖2B），表明涉及蛋白質合成。看來蛋白質降解機制不涉及這種調節，因為蛋白酶體抑制劑MG132或溶酶體抑制劑氯喹（CQ）未能阻止KEN介導的ADAM10增強（圖2C）。此外，作者排除了CDKs/GSK-3在ADAM10調節中的作用，因為單獨沉默CDK5或GSK-3β并不改變基礎條件下的ADAM10蛋白，并且未能進一步阻止KEN誘導的ADAM10蛋白水平增強（圖2D,E）。因此，作者接下來評估了翻譯機制是否介導了KEN的效應。如圖2F所示，翻譯抑制劑4EGI1，它破壞了真核翻譯起始因子E（eIF4E）-eIF4G相互作用，顯著降低了ADAM10蛋白的基礎水平，并進一步減弱了KEN對ADAM10的增強作用。通過轉染ADAM10構建，其中包括或刪除了5'UTR，作者發現5'UTR的缺失明顯增強了ADAM10的基礎水平，如先前報道的那樣，并且在−5'UTR但不是在+5'UTR中KEN誘導的ADAM10增強被減弱（圖2G）。進一步的5'UTR-熒光酶分析顯示核苷酸1–144和145–414足以介導KEN的功能（圖2H），而BACE1的5'UTR活性未發生改變（圖2I），這闡明了對ADAM10的選擇性調節。這些結果表明KEN通過5'UTR誘導ADAM10的翻譯。

圖2. KEN誘導的ADAM10翻譯依賴于5'UTR

  03、KEN促進了APP/PS1小鼠中ADAM10的表達并改善了認知缺陷

    作者接下來確定增強的ADAM10表達是否與體內淀粉樣蛋白生成和認知功能的改變相關聯（見圖3A）。野生型（WT）和APP/PS1小鼠被腹腔注射給予對照組（CRTL）或KEN，從而產生了以下四個組：WT、WT-KEN、APP/PS1和APP/PS1-KEN。鑒于KEN是CDK和GSK-3的抑制劑，這些蛋白激酶已知在選擇性位點包括Ser262（Tau262）和Ser396（Tau396）上磷酸化Tau，而這些磷酸化位點在APP/PS1小鼠的大腦中升高。因此，通過測量Tau262/396水平可以驗證KEN在大腦中的有效性。此外，ADAM10的底物之一，神經膠質相關細胞粘附分子（NrCAM），用于評估ADAM10激活劑的副作用。如圖3B所示，相對于APP/PS1小鼠，APP/PS1-KEN的Tau262/396蛋白水平顯著降低，表明KEN成功到達大腦并發揮了生物功能。ADAM10和sAPP的蛋白水平在WT和APP/PS1小鼠中均顯著升高，而NrCAM的水平未顯著升高，表明KEN選擇性地增強了ADAM10而避免了與神經突觸生長相關的副作用。作者進一步顯示在KEN治療的APP/PS1小鼠中，ADAM10蛋白水平的增強伴隨著Aβ沉積的減少。為了確定KEN是否會影響認知功能，作者使用水迷宮測試和上下文恐懼條件測試評估了APP/PS1小鼠的空間和聯想學習記憶。在隱藏平臺測試中，APP/PS1-KEN小鼠的逃避潛伏期顯著短于APP/PS1小鼠，從第三天開始（見圖3E）。在探索試驗中，當移除平臺時，APP/PS1-KEN小鼠在目標象限停留的時間（見圖3F）和穿越目標位置的通過時間（見圖3G）顯著長于APP/PS1小鼠，表明KEN改善了空間記憶（見圖3H）。隨后的上下文恐懼條件測試顯示，在APP/PS1-KEN小鼠中，凍結的次數（凍結次數）顯著增加，凍結的持續時間（凍結時間）顯著延長，與APP/PS1小鼠相比（見圖3I、J）。WT和WT-KEN之間未觀察到顯著差異。這些結果表明KEN顯著改善了APP/PS1小鼠的空間和聯想學習記憶。

圖3. KEN增強了ADAM10并拯救了APP/PS1小鼠的認知缺陷

  04、SHMT2是KEN和5'UTR相互作用RNA結合蛋白的靶基因

    為進一步理解KEN誘導的ADAM10翻譯的潛在機制，作者在SH-SY5Y-APP細胞中通過RNA-seq評估了不同調節的基因（DEGs），其中Aβ過度產生，從而在AD樣病理中重塑淀粉樣形成。作者構建了共表達網絡，以找到在有無KEN的情況下基因之間的關系。KEN誘導了共計733個DEGs，包括296個上調和437個下調的基因。上調的通路包括氨基酰-tRNA生物合成、氨基酸生物合成、碳代謝和葉酸一碳池。重要的是，SHMT2被確定為線粒體OCM中的中心基因。5'UTR的依賴性促使作者推測一些DEGs可能也作為RBPs在調節ADAM10翻譯中發揮作用。因此，作者進行了一個RNA結合實驗，其中ADAM10的5'UTR被5-溴尿嘧啶標記。作者發現在控制和KEN的情況下有兩組RBPs。進一步的蛋白質相互作用分析結果顯示，SHMT2與經典的RBPs和核糖體蛋白相互作用。SHMT2與YBX1和CSDE1的相互作用以及5'UTR的進一步驗證，說明了SHMT2是靶向5'UTR的RBP網絡的關鍵組成部分。Western blotting實驗證實，SHMT2蛋白水平受KEN劑量依賴性顯著增加，并且SHMT2敲除阻斷了KEN誘導的ADAM10表達增強。進一步的實驗表明，干擾SHMT2或5'UTR的小分子破壞了KEN誘導的ADAM10翻譯的調節。

圖4. SHMT2 是 KEN 和與 5′UTR 相互作用的 RBP 的靶基因

  05、SHMT2敲除減弱了KEN對APP/PS1小鼠中ADAM10和認知功能的影響

    作者接著確定了SHMT2是否也介導了KEN對ADAM10和淀粉樣物質生成的影響。作者在APP/PS1小鼠的海馬區雙側注射病毒AAV載體（對照組）或AAV-shSHMT2，在沒有KEN（AAV-shSHMT2-對照組）和有KEN（AAV-shSHMT2-KEN）的情況下，評估了與Aβ負荷和記憶功能相關的ADAM10蛋白水平。如圖5A所示，SHMT2蛋白水平的顯著降低同時伴隨著ADAM10和sAPP水平的顯著降低；當SHMT2被沉默時，KEN未能有效增強ADAM10/sAPP。此外，SHMT2的沉默顯著增加了海馬區Aβ的數量和強度，以及Aβ40/42水平，而這些變化不受KEN的影響（圖5B、C）。進一步的行為測試顯示，單獨SHMT2的沉默顯著損害了空間和客觀記憶，而額外的KEN未能引起進一步的行為改變（圖5D-K）。這些結果表明，在APP/PS1小鼠中，KEN誘導的對ADAM10、淀粉樣物質生成和認知功能的調控是通過SHMT2介導的。

圖5. 敲除 SHMT2 可減輕 KEN 對 ADAM10 和 APP/PS1 小鼠認知功能的影響

  06、SHMT2結合了大量與AD和KEN的細胞功能密切相關的RNA

    RNA結合特性表明SHMT2除了其酶活性外，還可以通過RNA處理來調節細胞功能。因此，作者在SH-SY5Y細胞中使用針對內源性SHMT2的抗體進行了RIP-seq。如圖6A所示，SHMT2在對照組和KEN處理組中分別招募了6266和6874個轉錄本（補充表RIP-Seq）。利用MEME程序進行的5226個在兩組中常見的RNA的基序分析顯示，SHMT2傾向于與富含GA和GC的基序相互作用（圖6A）。重要的是，兩組中的KEGG通路均包括核糖體、AD以及多種疾病的神經退行性變化（圖6B）。KEN特異性地影響了3401個轉錄本，包括那些僅在對照組或KEN中獨特存在，并且在兩組中都被KEN改變；KEGG分析顯示了代謝途徑和碳代謝與SHMT2功能一致，而其他通路包括RNA轉運也被包括在內（圖6C）。由于RNA-蛋白相互作用調節了RNA處理，作者推測SHMT2靶向的部分RNA可能會對KEN誘導的細胞功能變化發揮作用。利用KEN的DEGs數據（圖4A,B），作者評估了在KEN處理細胞中發生改變的SHMT2靶向mRNA。綜合分析顯示有112個基因重疊（圖6D），GO分析顯示轉錄因子活性和重要的翻譯起始因子活性受到影響，表明SHMT2結合的RNA豐度子集特別受到KEN的調節。這些結果表明，SHMT2通過優先與富含GA/GC的序列相互作用，作為RBP發揮作用，這些序列與AD以及KEN的細胞功能密切相關。

圖6. SHMT2靶向的RNA參與了AD和KEN的細胞功能

  07、SHMT2通過直接結合GAGGG基序來控制5′UTR活性

    為驗證SHMT2是否直接結合RNA并發揮其功能，作者使用ADAM10 mRNA的5′UTR不同片段進行電泳遷移實驗（EMSA）。如圖7A所示，人類全長5′UTR包含多個GAGGG/GAAAG序列，位置已標示。重組的SHMT2蛋白由小泛素樣修飾物（SUMO）標記，單獨的SUMO不結合任何這些片段（圖7B）。SHMT2僅結合包含GAGGG/GAAAG的片段，分別為69–90、156–175、176–200、201–222和223–244。相反，在RNA片段不包括GAGGG/GAAAG基序時，RNA-蛋白復合物（RPC）缺失（圖7B）。此外，當對應編號的片段中GAGGG/GAAAG基序發生突變時，未發現RPC（圖7C）。作者進一步展示，在100倍過量的非標記RNA存在時，RPC密度顯著降低（圖7D）。由于KEN還增強了小鼠細胞系和原代神經元中的ADAM10表達（圖1），因此作者隨后評估了小鼠來源的SHMT2-5′UTR結合。如圖7E所示，223nt長的小鼠5′UTR（NM_007399）包含多個GAGGG但不含GAAAG基序。SUMO標記的小鼠SHMT2僅結合包含GAGGG的片段1–29和30–57，而不結合不含GAGGG的片段58–86；而單獨的SUMO不結合這些片段。為進一步確認SHMT2是否控制了5′UTR的功能，作者評估了HEK細胞中SHMT2 siRNA的轉染后5′UTR活性。如圖7F所示，SHMT2敲除顯著降低了人類5′UTR的熒光素活性，并顯著減弱了KEN誘導的增強效應。這些結果表明，SHMT2直接結合了人類和小鼠來源的GAGGG基序，并調節了5′UTR的活性。

圖7. SHMT2 與 GAGGG 基序結合并控制 5′UTR 活性

  08、GAGGG突變影響了eIF2的核糖體掃描

    SHMT2偏好于GAGGG模體表明cis元素在調控RNA功能中很重要，尤其是ADAM10的5'UTR活性方面。為了弄清楚GAGGG模體在5'UTR功能中的作用，作者將ADAM10 5'UTR中位于26和56核苷酸處的野生型GAGGG突變為GAUUG（mut-ADAM10 5'UTR），并將其克隆到熒光素報告基因構建中。作者預測了相應的二級結構。相比于對照，mut-ADAM10 5'UTR顯示出了更高的自由能。令人驚訝的是，GAGGG突變（mut-GAGGG）導致5'UTR的熒光素活性顯著增強。作者進一步評估了敲除eIF2S1/2后的5'UTR luciferase活性，結果顯示mut-GAGGG的活性仍然顯著增加，表明GAGGG模體的突變使得RNA結構發生變化，從而增強了核糖體的掃描。綜上所述，GAGGG模體的存在與RNA結構和翻譯效率密切相關，SHMT2與GAGGG模體的結合可能改變RNA結構，促進ADAM10的翻譯，從而減少淀粉樣蛋白生成。

圖8. GAGGG 突變緩解了 eIF2 敲除對 5′UTR 活性的抑制

結論

    本研究揭示了SHMT2在調節與AD相關的RNA修飾中的作用，尤其是在KEN對ADAM10 5'UTR活性的影響中的介導作用。然而，SHMT2在調節多種生物學途徑方面的多面作用不支持將KEN-SHMT2的關聯作為治療AD的可能途徑，減少淀粉樣生成只是SHMT2多種效應之一。此外，KEN在動物模型中改善的認知功能也涉及到對Tau病理的減少，這可能與SHMT2無關，因為KEN是已知的GSK和CDK的抑制劑，這些激酶被認為是磷酸化Tau的。SHMT2在AD病理生理學中的詳細功能仍有待進一步澄清。

    在本文中，重組SHMT2蛋白由金開瑞生物提供。