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包涵體蛋白復性方法有哪些？

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2017-08-14 13:15:02

原核表達中因為各種內在和外在因素，外源蛋白表達過程中多數會形成不可溶形式的包涵體。由于包涵體產量高、穩定性好、容易純化等，包涵體蛋白已成為規模化制備蛋白產品的重要途徑。包涵體雖然有如此好的優點，但卻沒有生物活性，為了達到這一重要目標，各種復性機理及策略被研發出來，但是往往沒有一種通用的策略，而是需要結合表達蛋白的性質進行多次的嘗試才能獲得成功。

圖片來自麻省理工學院The Jonathan King Lab http://web.mit.edu/king-lab/www/research/Scott/Scott-Research.html

復性包涵體通常的步驟是洗滌—溶解—復性：洗滌去除了包涵體中的雜質后基本能得到高純度的重組蛋白，再用強變性劑進行溶解，此時用到的多數是高濃度的尿素或鹽酸胍，最后進行各種方法的復性，將強變性劑的濃度盡可能降低，得到有正確空間結構的重組蛋白。

復性常用的經典方法有三類：稀釋復性法（使用率最高）、透析復性法、超濾復性法。隨著技術的發展，許多新型方法也被開發，如高流體靜壓復性法（HHP）、色譜法、高壓復性法、反膠束復性法、沸石復性法、多壁碳納米管復性法、三相分離復性法等。

復性就是用外界方法促進蛋白進行正確折疊的過程，那么到底是什么影響了蛋白在復性過程中的折疊呢？研究表明，復性成功與否的主要影響因素還是蛋白質的自身性質，如等電點、分子內二硫鍵、蛋白的二級結構組成等。

1、等電點。蛋白的等電點pI值等于能讓其解離成陽離子和陰離子的程度相等使分子呈電中性的溶液pH值。當蛋白所處溶液pH=pI時，蛋白呈電中性，容易形成不穩定態聚集析出。在常規的鹽酸胍/尿素溶解的包涵體復性過程中，pI值小于6.0的蛋白更易被成功復性。

2、分子內二硫鍵。如果蛋白復性時能形成正確的二硫鍵，對復性的成功率會有很大的改善。因為大腸桿菌胞內的還原環境會抑制二硫鍵形成從而形成大量錯配的二硫鍵，所以對于有二硫鍵的蛋白在復性過程中需要加入氧化還原對（通常采用GSSH/GSSG）來控制復性的環境的氧化還原電勢以促進正確二硫鍵的形成。

3、蛋白的二級結構。蛋白的二級結構組成對復性過程也有一定程度的影響，但是不是主要因素。例如α螺旋和β折疊的比例增加會對復性的回收率產生不利影響，而轉角結構的比例增加則會起到一定的促進作用。

另外，環境因素對復性過程也有一定影響，對不同的蛋白進行不同條件的組合嘗試是很有必要的。

1、蛋白的濃度。復性的過程可以用如下的公式表示，其中D為變性蛋白，I為折疊中間體，N為天然構象蛋白，A為聚合體。反應①通常很迅速，反應②比較慢是折疊過程的限速步驟，反應③是不可逆的二級反應，在復性過程中需要盡量使變性蛋白濃度降低能，盡可能降低反應③的速率從而促進蛋白的正確折疊。

2、復性緩沖液pH。通常復性緩沖液的pH在7.0以上，如此可防止自由硫醇的質子化影響二硫鍵的正確配對，以8.0~9.0最為合適；

3、復性溫度。復性過程中反應溫度越高反應速率越快，會提高蛋白復性的速率，而由此引起的二硫鍵易錯配、聚集體容易大量形成也會大大降低復性蛋白的活性及復性回收率，故復性溫度一般選擇在常溫或更低的溫度。

4、復性時間。相對而言，結構越復雜、分子間次級鍵越多越復雜的蛋白，需要越長的復性時間使其形成正確的折疊。

復性過程一般會加入一些常規物質輔助復性，如氧化還原對（通常采用GSSH/GSSG）、低濃度尿素等，其他一些類型如低濃度變性劑、氨基酸、糖類、表面活性劑、多聚物、蛋白的輔因子、分子伴侶等物質也可促進包涵體的復性。

1、低濃度變性劑如尿素、鹽酸胍可以有效防止變性蛋白的分子間疏水作用力，從而抑制聚集體的形成。

2、L-Arg可以特異性結合于錯配二硫鍵及錯誤的折疊結構，使錯誤折疊的分子變得不穩定推動其向正確折疊的方向進行。

3、糖類如環糊精與分子伴侶有相似的構象，具有疏水性空腔，可結合變性蛋白多肽鏈的疏水性位點從而抑制其聚集失活，促進蛋白進行正確的折疊。

4、表面活性劑可以捕獲非天然狀態的蛋白形成復合物，起到阻止蛋白凝聚的作用，從而抑制折疊中間體的聚集，如SDS、磺基甜菜堿，但SDS只適用于某些蛋白，對某些蛋白的復性可能會起到不利的作用。

5、一些多聚物如PEG具有脂肪鏈結構，它可以通過結合到折疊中間體的非極性區域來組織中間體的聚集，從而促進蛋白的復性。

6、蛋白的輔因子如二價離子Zn2+、Cu2+可通過穩定折疊中間體從而促進蛋白的復性。

7、分子伴侶是原核和真核生物自身能表達的一類促進蛋白折疊的蛋白，分子伴侶的添加或共表達可促進外源表達蛋白的正確折疊，分子伴侶主要通過結合蛋白的疏水性區域，防止蛋白形成聚集體和錯誤配對。

包涵體蛋白的復性方法選擇和添加物的選擇，應結合蛋白本身的性質。例如對不含二硫鍵的蛋白復性體系中可加入DTE（Dithioerythritol），對于含二硫鍵的蛋白需加入氧化還原對如3 mM還原型和1 mM氧化型谷胱甘肽。對處于活性態時需要金屬離子的蛋白進行復性時則要避免體系中加入EDTA等螯合劑，而需要添加對應的金屬離子。另外，對包涵體蛋白進行復性是一個很復雜的過程，對某些外界條件需要進行逐步優化，多次嘗試才能得到最好的復性產率。

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