外源蛋白—大腸桿菌里的不速之客

信息來(lái)源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2017-08-09 16:08:01

作為最簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的外源蛋白表達(dá)方法，大腸桿菌外源蛋白表達(dá)技術(shù)深受大眾青睞，是最常用的表達(dá)方式。但是對(duì)小小的細(xì)菌而言，這些不速之客—外源蛋白，到底受不受歡迎呢？

有的情況下大腸桿菌對(duì)這個(gè)不速之客毫不客氣，等表達(dá)出來(lái)結(jié)果一看，完全沒(méi)有目的條帶，出現(xiàn)這種情況可能是因?yàn)椋?/div>

①二級(jí)翻譯起始位點(diǎn)的影響。當(dāng)基因起始密碼子后面有一個(gè)與核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）時(shí)，核糖體也會(huì)從這個(gè)位點(diǎn)開始翻譯可能導(dǎo)致截短、移碼等。

原核基因的核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列是mRNA起始密碼子上游約4~7 bp前的一段富含嘌吟短序列（5’-AGGAGG-3’）。這段序列與16S rRNA 3’端 3’-UCCUCC-5’區(qū)段完全互補(bǔ)，幫助16S rRNA識(shí)別以及從起始密碼子處開始翻譯。SD序列越強(qiáng)則基因表達(dá)水平越高，SD序列中GGAGG是弱SD序列偏好模式，AAGGA是強(qiáng)SD序列偏好模式，并且同一模式中SD序列距起始密碼子的距離不同所起到的調(diào)控作用也不同。例如，GGAG模式中堿基A在強(qiáng)SD序列中位于-8位，在弱SD序列中位于-7和-9位。

另外，在真核基因中核糖體會(huì)識(shí)別Kozak序列并將其作為翻譯起始位點(diǎn)。Kozak序列是一段位于起始密碼子上下游的模式，為—G/N-C/N-C/N-ANNATGG—的短序列，其中3位的A堿基對(duì)翻譯效率有著重要影響。根據(jù)Kozak規(guī)則（見(jiàn)下圖），—GCCACCATGG—、—GCCATGATGG—的序列轉(zhuǎn)錄和翻譯效率最高。所以，真核表達(dá)中的引物設(shè)計(jì)需在ATG前加上—GCCACC—促進(jìn)目的蛋白的表達(dá)。

②稀有密碼子影響。密碼子總共有64種，多數(shù)物種不會(huì)以相同的頻率使用而是有偏愛(ài)性地使用其中一部分，我們稱某個(gè)物種不常用的那些密碼子為稀有密碼子。例如在大腸桿菌、酵母細(xì)胞、果蠅體內(nèi)表達(dá)高豐度蛋白的mRNA序列里表現(xiàn)出某種程度的密碼子偏愛(ài)。每個(gè)物種偏愛(ài)的密碼子不盡相同，在進(jìn)行蛋白表達(dá)時(shí)，外源蛋白基因含有的某些密碼子因?yàn)椴槐凰拗骷?xì)胞所偏愛(ài)可能會(huì)導(dǎo)致表達(dá)效率低下。

在翻譯過(guò)程中，核糖體在稀有密碼子組成的mRNA上的移動(dòng)速率比不含稀有密碼子的慢，成簇的稀有密碼子則會(huì)抑制核糖體的移動(dòng)。當(dāng)稀有密碼子簇位于mRNA的3’端或5’端時(shí)均會(huì)顯著降低蛋白的表達(dá)水平，散在分布的稀有密碼子對(duì)蛋白翻譯的影響則有負(fù)面效應(yīng)。在大腸桿菌外源蛋白表達(dá)中，某些外源基因本身含有較多稀有密碼子，在起始密碼子后15 bp內(nèi)的稀有密碼子會(huì)對(duì)蛋白表達(dá)有著顯著的影響，可以使用基因合成的方式進(jìn)行密碼子優(yōu)化，不過(guò)這種方法對(duì)原核宿主內(nèi)表達(dá)蛋白有較好的效果，卻對(duì)真核宿主的影響不大，只能起到錦上添花的效果。

③mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。如果基因序列里存在與核糖體結(jié)合位點(diǎn)和/或翻譯起始位點(diǎn)互補(bǔ)的序列，則轉(zhuǎn)錄形成的mRNA可能會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致翻譯停止。可以采用同義密碼子替換的方式進(jìn)行優(yōu)化，即采用基因合成的方式進(jìn)行優(yōu)化，提高目的蛋白的表達(dá)量。

④GC含量的影響。眾所周知，GC含量在PCR反應(yīng)中是一個(gè)重要指標(biāo)。除此之外，基因的GC含量也影響著轉(zhuǎn)錄出的mRNA熱力學(xué)穩(wěn)定性及二級(jí)結(jié)構(gòu)，如果表達(dá)序列中GC含量超過(guò)70%則可能會(huì)導(dǎo)致蛋白在大腸桿菌中表達(dá)水平降低。

⑤轉(zhuǎn)錄終止子的影響。轉(zhuǎn)錄終止子可以促進(jìn)蛋白的表達(dá)，缺少時(shí)就會(huì)造成“通讀”，也就是轉(zhuǎn)錄一直進(jìn)行下去。在pET系列載體里目的基因的反方向有一個(gè)選擇性標(biāo)記基因防止目的基因轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)生“通讀”，要是目的基因的方向與這個(gè)標(biāo)記基因方向一致（不同的載體標(biāo)記基因的方向是不一定的）而且后面沒(méi)有一個(gè)終止子，那么目的基因就會(huì)和標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中不斷競(jìng)爭(zhēng)生成mRNA，可能會(huì)降低目的蛋白的表達(dá)量。

⑥mRNA的穩(wěn)定性。大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)mRNA穩(wěn)定性并不高，如果在mRNA 5’-非翻譯區(qū)和3’-rho非依賴性終止子處插入穩(wěn)定結(jié)構(gòu)序列，則可以起到增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性的作用。例如mRNA 5’端的不帶突出的發(fā)夾結(jié)構(gòu)能通過(guò)延長(zhǎng)mRNA半衰期使其穩(wěn)定性大大增加。

⑦翻譯終止效率。翻譯終止效率對(duì)蛋白的表達(dá)量有很大的影響，更有效的翻譯終止可以促進(jìn)蛋白表達(dá)。絕大多數(shù)生物都有偏愛(ài)的圍繞終止密碼子的序列框架。例如，酵母和哺乳動(dòng)物偏愛(ài)的終止密碼子分別是UAA和UGA，單子葉植物最常利用UGA，而昆蟲和大腸桿菌傾向于用UAA。大腸桿菌里終止密碼子序列—UAA(U)—可使翻譯效率達(dá)80%，而—UGA(C)—序列則只有7%。

有的情況下大腸桿菌對(duì)這個(gè)不速之客比較友好，但是卻把目的蛋白變成了包涵體而不是可溶形式在細(xì)胞里活蹦亂跳。包涵體是何方神圣？原來(lái)當(dāng)外源基因在原核細(xì)胞中尤其是大腸桿菌中高效表達(dá)時(shí)，會(huì)聚集形成由膜包裹的高密度、不溶性顆粒，成分包括50%以上的重組蛋白及核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，包括環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等形式。這些顆粒的形成原因主要有以下幾種：

①表達(dá)量過(guò)高。當(dāng)?shù)鞍椎暮铣伤俣冗^(guò)快，會(huì)使蛋白來(lái)不及正確折疊及形成正確的二硫鍵，加上包涵體的形成也能降低胞內(nèi)外源蛋白的濃度更促進(jìn)了包涵體的形成。所以某些蛋白在大腸桿菌里表達(dá)會(huì)形成大量的包涵體，這些過(guò)量的蛋白間非特異性結(jié)合起來(lái)，使得蛋白無(wú)法達(dá)到足夠的溶解度，形成包涵體。

②異源性影響。多數(shù)重組蛋白對(duì)大腸桿菌而言是異源的，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)缺乏真核細(xì)胞翻譯后修飾所需的酶類，對(duì)某些需要修飾的真核蛋白，其在大腸桿菌里表達(dá)出來(lái)的蛋白中間體由于未得到及時(shí)修飾會(huì)大量積累形成沉淀。例如真核糖蛋白由于無(wú)法糖基化使得中間體聚集形成包涵體。

③分泌信號(hào)肽的影響。某些重組蛋白的分泌信號(hào)肽也會(huì)影響蛋白的折疊，它可能會(huì)使蛋白折疊成一個(gè)錯(cuò)誤的構(gòu)象導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊分子的產(chǎn)生，降低了蛋白的溶解度。

④蛋白氨基酸組成。通常蛋白序列里含硫氨基酸比例越高則越容易形成包涵體，而脯氨酸（Pro）的比例也明顯與包涵體的形成呈現(xiàn)正相關(guān)。

⑤環(huán)境因素。包涵體是由部分變性的中間體聚合而成，所以影響中間體穩(wěn)定性的各種環(huán)境因素都可能導(dǎo)致包涵體的形成。例如大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的pH如果接近目的蛋白等電點(diǎn)pI則容易形成包涵體，另外培養(yǎng)基的離子強(qiáng)度不合適、培養(yǎng)溫度過(guò)高等因素也可能引起中間體的聚合反應(yīng)形成包涵體。

因此，在表達(dá)外源蛋白之前，要對(duì)目的基因及目的蛋白進(jìn)行各方面的分析，選擇合適的表達(dá)載體、表達(dá)條件，才能得到理想的蛋白。

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