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抗體純化方法有哪些？

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2017-09-12 10:51:42

抗體制備出來之后，需要進一步純化得到純的多抗或單抗，既有利于保存也有利于排除雜蛋白對結果的影響。常規用于純化的材料是腹水和細胞培養上清，而通常經過免疫制備的抗體大多數是IgG的各種亞型，以及少數是IgM，二者電泳條帶分步大致如下：

硫酸銨沉淀法

基本原理：高濃度的硫酸銨通過與球蛋白競爭水分子破壞蛋白表明的水化膜，降低球蛋白的溶解性，是分離免疫球蛋白的常用方法，而且不同的免疫球蛋白適宜的硫酸銨濃度也稍有差別，一般用來分離抗體的硫酸銨飽和度在33~50%。

適用于：鼠抗所有亞類、其他種屬抗體、任何種屬的IgM、IgG、IgA

基本操作：

1.過濾、離心腹水或者培養上清得上清；

2.加入飽和硫酸銨至終濃度45%，靜置沉淀蛋白；

3.沉淀蛋白用最小體積PBS或硼酸鹽緩沖液溶解，用PBS或硼酸鹽緩沖液透析除鹽；

4.過聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠柱，PBS或硼酸鹽（含0.02%疊氮鈉）緩沖液洗脫；

5.電泳檢測分子量大小，分光光度法測定抗體濃度；

6.抗體保存濃度在0.1-30 mg/mL適宜，-20 ℃保存不超過一個月，避免反復凍融。

親和層析法

基本原理：基因工程改造的protein A和protein G能特異性結合哺乳動物IgG的Fc區段，將protein A和protein G結合到柱料上，通過親和層析的方式，可將IgG及其亞類與片段純化出來。

成員介紹：protein A分離自Staphylococcus aureus的細胞壁，分子量42 kDa，由spa基因編碼，具有五個同型的免疫球蛋白結合結構域，每個結構域由三個α螺旋構成。

protein A的B結構域

protein A的各個結構域

protein A可結合多數免疫球蛋白的Fc段（尤其是人的IgG1、IgG2、IgG4，豚鼠，獼猴，鼠類IgG2a、兔）以及人VH3家族的Fab段。基因工程改造的protein A通常使用大腸桿菌作為表達宿主，表達產物仍含有五個Fc結合結構域。對其結構上的改造主要是為了增加與多孔性材料的偶聯性能，也有的改造protein A含有四個或六個同型Fc結合結構域，另外結構域數目較少的protein A能得到更好的抗體純化效果。

protein G分離自G Streptococcus的細胞壁，分子量65 kDa，由spg基因編碼，可結合抗體的Fc段、Fab段以及血清中的白蛋白。基因工程改造的protein G去掉了與白蛋白的結合位點僅僅保留Fc結合結構域，其結合力較protein A更強。

protein G的B結構域

protein G的各個結構域

還有一種protein A/G蛋白，是基因工程改造產物，是將protein A的4個Fc結合結構域與protein G的2個Fc結合結構域融合表達得到的。protein A/G結合了二者的特性，能結合人和鼠的IgG所有亞型，不結合鼠的IgA、IgM。

①protein A親和層析

適用于：人（IgG3除外）、兔、豚鼠、豬的抗體；

基本操作：

1.過濾、離心腹水或者培養上清得上清；

2.調節pH到8.0：腹水以10倍體積pH8.0 PBS稀釋、培養上清用pH8.0 PBS透析或強氧化鈉調節；

3.過protein A瓊脂糖凝膠柱，pH8.0 PBS洗雜；

4.檸檬酸緩沖液洗脫抗體（小鼠IgG1用pH6.5，IgG2a用pH4.5，IgG2b和IgG3用pH3.0），并注意收集管內需加入Tris緩沖液中和滴下的抗體溶液；

5.用PBS透析；

6.電泳檢測分子量大小，分光光度法測定抗體濃度。

②protein G親和層析

與protein A相比，protein G通常情況下在低pH環境下與抗體結合力較強，不過高pH環境下小鼠IgG1和兔、人的抗體在仍可以與protein G結合。

適用于：小鼠IgG1、大鼠抗體、猴抗體、兔抗體、牛抗體、山羊抗體、馬抗體、綿羊抗體；

基本操作：

1.過濾、離心腹水或者培養上清得上清；

2.調節pH到5.0：腹水以10倍體積0.1 M醋酸鈉（pH5.0）稀釋、培養上清以2倍體積0.1 M醋酸鈉（pH5.0）稀釋；

3.過protein G柱，0.1 M醋酸鈉（pH5.0）洗雜；

4.0.1 M甘氨酸（pH2.8）洗脫抗體，并注意收集管內需加入Tris緩沖液中和滴下的抗體溶液

5.用PBS透析；

6.電泳檢測分子量大小，分光光度法測定抗體濃度。

③抗原親和層析法

抗原親和純化一般用在多抗的純化上，這種純化方式去掉了血清中那些非特異性結合的抗體分子，得到的抗體分子基本上都是能特異性與抗原結合的。抗原親和純化需要先將抗原偶聯到柱料上，然后通過親和層析的方式去除非特異性抗體及雜蛋白，得到特異性抗體。通常采用的柱料為溴化氫預處理和N-羥基琥珀酰亞胺預處理瓊脂糖凝膠柱料，前者適合偶聯大分子，后者適合偶聯小分子物質，在實際操作中還是需要根據情況進行選擇。

適用于：多抗抗體的純化，對抗體亞型無限制

偶聯基本操作：

1.抗原用0.1 M NaHCO3偶聯緩沖液（含0.5 M NaCl，pH8.3）溶解；

2.用1 mM稀鹽酸洗滌柱料；

3.混合抗原和柱料，在室溫混懸1 h或者4 ℃混懸過夜；

4.用偶聯緩沖液洗滌偶聯的柱料去掉未偶聯抗原；

5.用0.1 M Tris（pH8.0）或1 M乙醇胺（pH8.0）處理偶聯柱料2 h以封閉未偶聯位點；

6.依次用0.1 M醋酸鈉緩沖液（含0.5 M NaCl，pH4.0）和0.1 M Tris（含0.5 M NaCl，pH8.0）洗滌偶聯柱料五次，重復此操作三遍。

純化基本操作：

1.過濾、離心腹水或者培養上清得上清；

2.0.01 M PBS（pH7.4）平衡偶聯柱料；

3.抗體樣品過柱，0.01 M PBS（pH7.4）洗雜；

4.抗體洗脫液洗脫抗體；

5.用0.01 M PBS（pH7.4）透析；

6.電泳檢測分子量大小，分光光度法測定抗體濃度。

隨著技術的發展抗體的純化方法越來越多，例如分子篩層析、離子交換層析等技術也被用于抗體的純化，在實際運用中需要根據實驗目的及其他因素進行方法的選擇。

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