實驗心得：免疫共沉淀的步驟
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2017-09-13 17:30:40
免疫共沉淀（co-IP）的具體步驟：
1. 細胞用預冷的PBS液洗滌2次，最后洗滌完成后吸干PBS液。
2. 加入預冷的RIPA Buffer（1ml/107個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶）。
3. 刮留細胞：用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶中上刮下，將懸液轉入1.5mlEP管中，EP管插冰上，置于水平搖床上緩慢晃動15min。
4. 4℃，14000g離心15min。
5. 立即將上清液轉移到一個新的離心管中。
6. 準備Protein A瓊脂糖，用PBS液洗兩遍珠子，然后用PBS液配制成50%濃度。
*為避免操作中破壞瓊脂糖珠，減掉移液器槍頭的尖部分。
7. 每ml總蛋白中加入100ul Protein A瓊脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平搖床上4℃搖晃10min。
*目的是去除非特異性雜蛋白，可降低背景。
8. 4℃，14000g 離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中。
9. 測定蛋白濃度，可選用Bradford法做蛋白標準曲線。
10. 蛋白定量，分裝，-20℃保存，可保存1個月。
11. 用PBS液將總蛋白稀釋至約1ug/ml。
12. 加入500ul稀釋好的兔抗到總蛋白中。
13. 于搖床上4℃緩慢搖動抗原抗體混合物，可選擇過夜或室溫放置2h。
14. 加入100ul Protein A瓊脂糖珠用以捕捉抗原抗體復合物，搖床4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或者室溫孵育1h。
15. 14000rpm瞬時離心5s，去上清，收集瓊脂糖珠-抗原抗體的復合物。
16. 用800ul預冷RIPA buffer沖洗3遍。
17. 用60ul 2倍上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕敲打混勻。
18. 將上樣樣品煮5min。
19. 14000g離心，收集剩余瓊脂糖珠。
20. 將上清電泳，電泳前應再次煮5min變性。
21. 上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳。
基礎成分
（1）Tris-HCl（防止蛋白變性的緩沖液成分）
（2）NaCl（防止非特異性蛋白聚集的鹽分）
（3）NP-40（用H2O配置成10%儲存液。NP-40為非離子去污劑，用于提取蛋白）
（4）去氧膽酸鈉（用H2O配置成10%儲存液；提取蛋白用離子去污劑；避光保存）
*因為離子型去污劑能夠使酶變性，導致活性喪失，準備激酶（致活酶）實驗時，不要加去氧膽酸鈉。
1. 細胞用預冷的PBS液洗滌2次，最后洗滌完成后吸干PBS液。
2. 加入預冷的RIPA Buffer（1ml/107個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶）。
3. 刮留細胞：用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶中上刮下，將懸液轉入1.5mlEP管中，EP管插冰上，置于水平搖床上緩慢晃動15min。
4. 4℃，14000g離心15min。
5. 立即將上清液轉移到一個新的離心管中。
6. 準備Protein A瓊脂糖，用PBS液洗兩遍珠子，然后用PBS液配制成50%濃度。
*為避免操作中破壞瓊脂糖珠，減掉移液器槍頭的尖部分。
7. 每ml總蛋白中加入100ul Protein A瓊脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平搖床上4℃搖晃10min。
*目的是去除非特異性雜蛋白，可降低背景。
8. 4℃，14000g 離心15min，將上清轉移到一個新的離心管中。
9. 測定蛋白濃度，可選用Bradford法做蛋白標準曲線。
10. 蛋白定量，分裝，-20℃保存，可保存1個月。
11. 用PBS液將總蛋白稀釋至約1ug/ml。
12. 加入500ul稀釋好的兔抗到總蛋白中。
13. 于搖床上4℃緩慢搖動抗原抗體混合物，可選擇過夜或室溫放置2h。
14. 加入100ul Protein A瓊脂糖珠用以捕捉抗原抗體復合物，搖床4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或者室溫孵育1h。
15. 14000rpm瞬時離心5s，去上清，收集瓊脂糖珠-抗原抗體的復合物。
16. 用800ul預冷RIPA buffer沖洗3遍。
17. 用60ul 2倍上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕敲打混勻。
18. 將上樣樣品煮5min。
19. 14000g離心，收集剩余瓊脂糖珠。
20. 將上清電泳，電泳前應再次煮5min變性。
21. 上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳。
基礎成分
（1）Tris-HCl（防止蛋白變性的緩沖液成分）
（2）NaCl（防止非特異性蛋白聚集的鹽分）
（3）NP-40（用H2O配置成10%儲存液。NP-40為非離子去污劑，用于提取蛋白）
（4）去氧膽酸鈉（用H2O配置成10%儲存液；提取蛋白用離子去污劑；避光保存）
*因為離子型去污劑能夠使酶變性，導致活性喪失，準備激酶（致活酶）實驗時，不要加去氧膽酸鈉。
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