雙熒光素酶報告基因的應用，常見載體及案例簡介
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2022-11-01 14:31:43
雙熒光素酶報告基因檢測（Dual-Luciferase Reporter Assay）通常以螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)為報告基因，以海腎螢光素酶(Renilla luciferase)為內參基因。所構成的報告系統具有靈敏度高、動態范圍廣、應用靈活等優勢，廣泛用于基因調控、非編碼RNA靶向互作等研究領域。
Firefly luciferase（簡稱F-Luc）以熒光素(luciferin)為底物，在Mg2+、ATP和氧分子存在條件下，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在此過程中發出最強波長在560nm左右的生物熒光(bioluminescence)。F-Luc表達框的上游啟動子區域插不同功能序列，可以通過轉錄起始條件造成其報告熒光的變化。在F-Luc的3’UTR區域插入待驗證的靶序列，通過其翻譯抑制或mRNA穩定性降低，可以反映是否存在靶向互作。
Renilla luciferase（簡稱R-Luc）以腔腸素（coelenterazine）為底物，在氧分子存在的條件下催化coelenterazine氧化生成coelenteramide，此過程中發出最強波長在465nm左右的生物熒光。R-Luc通常由固定組成型啟動子驅動，在報告系統中作為校正input誤差的內參信號。
生物熒光產生反應式
一、應用方向
1. 驗證microRNA同mRNA靶向互作。將待測mRNA的3’UTR序列插入報告基因載體，再共轉入該microRNA，如果熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。
2. 驗證microRNA同lncRNA靶向互作。將候選的lncRNA序列插入報告基因載體中F-Luc的3’UTR區域，檢測熒光素活性。
3. 啟動子結構分析。將啟動子區域序列（通常2k左右）進行分段截短，或對特定位點進行突變，再分別構建入luciferase報告載體，檢測其啟動子活性。
4. 啟動子SNP分析。一些基因的啟動子區域存在單核苷酸多態性，可運用熒光素酶報告系統分析其相對活性。
5. 驗證特定轉錄因子同其調控序列的作用。將該序列（通常為啟動子區域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞中共轉過表達該轉錄因子，可分析轉錄因子過表達是否提高熒光素酶活性。
6. 可以分析信號通路是否激活。將該信號通路的下游響應原件序列構建入報告基因載體，在不同上游信號條件下，熒光素酶活性代表了通路的下游響應。例如，在GPCR研究中，將cAMP response element（CRE）載入報告基因載體，構建穩定表達細胞株后，可以用于分析GPCR的激活與抑制劑篩選。又如，將HIF1α的響應原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase報告載體構建穩轉細胞株，可以用于低氧相關通路的研究。
二、常用熒光素酶報告基因載體
pGL3-Basic
pRL-TK
pmirGLO
三、經典案例
案例一題目：Long non-coding RNA linc00673 regulatednon-small cell lung cancer proliferation,migration, invasion and epithelialmesenchymal transition by spongingmiR-150-5p
期刊：Molecular Cancer
小結：驗證linc00673具有miR-150-5p的靶向結合位點。將linc00673包括預測結合位點的序列克隆到pmirGLO- linc00673-WT，同時構建靶位點突變的pmirGLO- linc00673-MUT，分別共轉miR-150-5p mimics及NC mimics，結果顯示miR-150-5p轉染組的相對熒光值降低，提示存在靶向結合。
圖：RNA與質粒共轉染293T，24h后雙熒光素酶檢測
題目：SOX9 indirectly regulates CEACAM1 expression and immuneresistance in melanoma cells
期刊：Oncotarget
小結：驗證SOX9對于CEACAM1的轉錄調控作用。分別使用了兩種黑色素瘤細胞526mel和624mel，對CEACAM1的啟動子區域分別選擇了600bp-200bp的截短片段，共轉染過表達SOX9，顯示SOX9能夠抑制CEACAM1啟動子的轉錄。
圖：截短的pCEACAM1進行雙熒光素酶檢測
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