一、慢病毒使用安全使用規范

        慢病毒中的毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒因此沒有毒性作用。但該病毒仍然具有可能的潛在的生物學危險，不建議使用編碼已知或可能會致癌的基因的假型病毒。除非已經完全公認某個基因肯定沒有致癌性，否則均不建議采用假型病毒進行生物學實驗。使用時請參照如下所示進行實驗：

        1．病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺操作病毒，請不要打開排風機。

        2．病毒操作時請穿實驗服，帶口罩和手套。
 
        3．操作病毒時特別小心不要產生氣霧或飛濺。如果操作時超凈工作臺有病毒污染，請立即用70%乙醇加1%的SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭，離心管，培養板，培養液請于84 消毒液或1%SDS 中浸泡過夜后棄去。

        4．用顯微鏡觀察細胞感染情況時應遵從以下步驟：擰緊培養瓶或蓋緊培養板。用70%乙醇清理培養瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實驗臺之前，用70%乙醇清理顯微鏡實驗臺。

        5．如需要離心，應使用密封性好的離心管，或者用封口膜封口后離心，而且盡量使用組織培養室內的離心機。

        6．脫掉手套后，用肥皂和水清洗雙手。

二、慢病毒用于體外（In Vitro）實驗：

        感染培養原代細胞和建系細胞。慢病毒對各種細胞和組織的親嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通過查閱相關文獻，了解慢病毒對您的目的細胞的親嗜性，感染復數（MOI 值）以及在體（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果沒有相關文獻支持，可以通過感染預實驗得到合適的感染復數（MOI 值）（使用24孔板檢測病毒對目的細胞的親嗜性）。

      慢病毒感染目的細胞預實驗

        1.  慢病毒感染目的細胞預實驗注意事項：
        ① 測定慢病毒對目的細胞的親嗜性時，需要同時設置對慢病毒親嗜性較高的細胞(HEK293T，Hela）作為平行實驗的對照細胞。
        ② 在進行慢病毒感染實驗時，可以用完全培養基（培養目的細胞用）稀釋；理論上，含有血清，雙抗或者其他營養因子的完全培養基不影響慢病毒的感染效率。
        ③ 一般慢病毒單位為TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆粒數。如：病毒滴度為>1X10⁸ TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X10⁸個具有生物活性的慢病毒顆粒。

        2.  以24孔培養板為例，進行目的細胞和HEK293T 細胞的感染預實驗實驗前按照不同的MOI設置不同的感染孔，并根據MOI和細胞數量計算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者無血清培養基稀釋病毒原液。

        第一天，準備細胞：在24孔培養板接種若干孔，每個孔內接種3~5X104個目的細胞，鋪板時細胞的融合率為50%左右，每孔培養基體積為100 μl；進行病毒感染時細胞的融合度約為70%左右。

        第二天，準備病毒：取出4℃保存的病毒，使用臺式離心機離心20 秒（使病毒完全懸于離心管底部即可）；如果是凍存在-80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據實驗室的實際情況將按照MOI準確計算好的慢病毒稀釋到培養基中，并盡可能保證所獲得的含有慢病毒的培養基的總體積為最小體積，以期獲得最佳的感染效率。

        第二天，感染目的細胞：病毒準備好之后，從培養箱中拿出細胞，首先察細胞生長狀態，如細胞狀態較好則開始實驗。
        a使用移液器吸取準確體積的病毒液加入準備好的培養基。
        b吸去培養基的培養器皿中的培養基（如果細胞生長良好，密度適宜，則不用換液）。
        c在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液。
        d混勻后放于二氧化碳培養箱（37℃、5%CO₂）孵育過夜。
        注：感染前細胞的狀態好壞對最終的感染效果高低影響很大，所以務必保證加病毒之前細胞處于良好的生長狀態。亦可以將預先準備好的培養基和慢病毒的混合液直接加入培養器皿中。慢病毒對目的細胞的感染效率較低，通過提高MOI 值可以提高病毒的感染效率，但是當MOI高于20時，我們建議在培養基中加入ploybrene（8 μg/ml左右）來提高病毒的感染效率。

        第三天，更換培養液：一般在24小時候后將含有慢病毒的培養液更換成正常培養液；在感染后觀察細胞狀態，如果慢病毒對細胞有明顯毒性作用而影響細胞生長狀態，可以最短在加病毒4小時候更換新鮮培養液后繼續培養（建議在8-12小時更換為宜）。第一次換液后，如果慢病毒對細胞沒有明顯毒性作用，按照正常培養條件培養換液。

        第六天，感染效率檢測：在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計慢病毒感染目的細胞的效率；如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶Marker Gene的，可以通過Real-timeRT-PCR檢測目的基因的表達來拍評估感染效率。

      注意：
      有些慢病毒載體上帶有GFP 綠色熒光蛋白，使用者可以在病毒感染96小時后用倒置熒光顯微鏡觀察GFP 綠色熒光，以觀察病毒對目的細胞的感染情況。如果慢病毒載體攜帶其他Marker Gene如RFP\BFP可以用熒光顯微鏡在對應的激發光波長下觀察熒光表達的情況。
      慢病毒表達時間較慢，熒光表達所需時間較長，建議感染后96小時后觀測熒光表達。
      感染后的細胞可以連續培養一周，通過觀察熒光的表達時間和表達強度來確定慢病毒對目的細胞的感染情況。感染期間請根據細胞生長的情況對細胞進行及時換液，以保證細胞良好的生長狀態。

三、慢病毒的儲存與稀釋:

        1.  病毒的儲存：收到病毒液后在很短時間內即使用慢病毒進行實驗，可以將病毒暫時放置于4 ℃保存；如需長期保存請放置于-80℃（病毒置于凍存管，并使用封口膜封口）
        ① 病毒可以存放于-80℃ 6個月以上；但如果病毒儲存時間超過6個月，建議在使用前需要重新滴定病毒滴度
        ② 反復凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度10%；因此在病毒使用過程中應僅盡量避免反復凍融，為避免反復凍融,建議收到病毒后按照每次的使用量進行分裝。

        2.  病毒的稀釋：如果需要稀釋病毒，請將病毒取出置于冰浴融解后，使用培養目的細胞用PBS或無血清培養基(含血清或含雙抗不影響病毒感染)?；靹蚍盅b后4℃保存(請盡量在三天內用完) 分裝后使用。  
 
 四、懸浮細胞感染方法概要

       1.  根據細胞的量將細胞在1.5ml 管中離心收集然后用100-200ul 的無血清培養液稀釋細胞沉淀，以細胞完全浸沒在培養基中為準。

       2.  按照MOI 換算病毒顆粒數量，吸取病毒液加入細胞中，將1.5ml 管放在37℃度培養箱中孵育30 分鐘。

       3.  將管中混合溶液吸出加到培養皿中或孔里。
 
       4.  加入足夠量的新鮮培養液。

       5.  12 小時后換液。

       6.  96 小時后觀察細胞陽性率。


五、相關專業術語：
        MOI：病毒感染復數傳統的MOI 概念起源于噬菌體感染細菌的研究。其含義是感染時噬菌體與細菌的數量比值，也就是平均每個細菌感染噬菌體的數量。噬菌體的數量單位為pfu。一般認為MOI 是一個比值，沒有單位，其實其隱含的單位是pfu number/cell。后來MOI 被普遍用于病毒感染細胞的研究中，含義是感染時病毒與細胞數量的比值，本手冊中提到的MOI都是沿用這個概念。然而，由于病毒的數量單位有不同的表示方式，從而使MOI 產生了不同的含義。能產生細胞裂解效應的病毒例如單純皰疹病毒等習慣上仍用pfu 表示病毒數量，因此其MOI 的含義與傳統的概念相同。


 六、細胞培養器皿的相關參數
 

Flask/Dish	Surface (mm)	Cell number	Media Volume
96 well plate	50	1.5-5.0×10	100 μl
48 well plate	100	3.0×104-1.0×10	200 μl
24 well plate	200	8.0×104-2.0×10	500 μl
12 well plate	401	1.6-4.0×10	1.0 ml
6 well plate	962	3.0-8.0×10	2.0 ml
35mm	962	3.0-8.0×10	2.0 ml
60mm	2827	1.0-2.5×10	6.0 ml
100mm	7854	2.5-6.4×10	10.0 ml