蛋白質與RNA的相互作用是許多細胞功能的核心，如蛋白質合成、mRNA組裝、病毒復制、細胞發育調控等。蛋白-核酸互作是機制研究的重要組成部分，是表現、功能等研究的進一步深化。今天小編以一篇經典文獻帶你了解蛋白-核酸互作研究方法。

經典文獻解讀：MYC調控的長鏈非編碼RNA（lncRNAs）在細胞周期調控和腫瘤發生中的作用

基本信息
題目：Role of MYC-Regulated Long Noncoding RNAs in Cell Cycle Regulation and Tumorigenesis
期刊：Journal of the National Cancer Institute (JNCI)
影響因子：12.589
主要技術：RNA pull-down , LC-MS/MS, ChIP, RIP

研究背景
         哺乳動物基因組編碼大量的非編碼RNA，如microRNAs、piRNAs和lncRNAs。迄今為止，已經注釋或鑒定了3萬多個lncRNAs。目前已經在幾種癌癥中鑒定到lncRNAs，在結直腸癌（CRC）中也有一些報道，如CCAT1和CCAT2，但大部分lncRNAs 在CRC中的作用仍然鮮為人知，有待闡明。已知轉錄因子MYC調節lncRNAs并且與癌細胞增殖和腫瘤發生相關。本文作者利用熒光素酶啟動子測定，ChIP，RNA pull-down，缺失圖譜測定，LC-MS / MS和RIP等方法手段來探索MYC調控lncRNAs的相關機制。
研究內容及結果
1. 鑒定結直腸癌（CRC）中特異表達的lncRNAs
         作者利用lncRNAs基因芯片來分析正常結腸來源和CRC來源的細胞和組織中的lncRNAs。結果獲得30215個蛋白質編碼轉錄本和33045個有注釋或已知的lncRNAs。其中在CRC中具有表達差異的蛋白質編碼轉錄本（2212/30215）和lncRNAs(2325/33045)具有相似的比例，均為7%（圖1，A和B）。
在2325個差異表達的lncRNAs中，有1265個上調和1060下調（圖1C）。作者選取差異倍數大于15倍，P <0.01的差異表達的lncRNAs進行RACE快速擴增, 然后利用qRT-PCR進行驗證。結果有4個lncRNAs（CCAT3、CCAT4、CCAT5和CCAT6）在CRC細胞系中上調表達（圖1, D-G），CCAT7和CCAT8在CRC細胞系中下調表達（圖1，H-I）。利用52個CRC組織和它們臨近的正常組織（NATs）進行驗證也證實了上述結果（圖J-O）。  
2. 進一步鑒定原癌基因MYC調控的CRC相關lncRNAs
        為進一步鑒定由MYC調控的CRC相關lncRNAs的差異表達，作者利用lncRNAs微陣列篩選siMYC處理的CRC派生細胞系中的lncRNAs。結果，在HCT116細胞系和RKO細胞系中分別鑒定到324、863個由MYC調節的lncRNAs（圖2B,C）。通過進一步篩選獲得MYC上調的三種lncRNAs（AK021907，AC074389.9和KTN1-AS1）（圖2D）。這些由MYC調控的lncRNAs 被命名為MYCLos（MYCLos-1，MYCLos-2，MYCLos-3）。
接下來作者研究了由MYC介導調控的MYCLos在各種癌細胞中是否常見。結果表明，在各種癌癥類型的細胞中都能觀察到MYC介導調控MYCLos，表明MYC介導調控MYCLos在多種類型的癌癥中是保守的（圖2E-G）。
        為了進一步驗證MYC與MYCLos之間的關系，作者還研究了50個人類原發性結直腸癌組織樣本(25個正常結腸和25個CRC組織樣本)的表達水平，根據MYC表達水平分為4個組(圖2H)。通過比較四組中MYCLo-1，-2和-3的表達水平，發現MYCLo-1，-2和-3的表達水平與MYC的表達水平在統計學上顯著相關（圖2，I-K）。此外，MYCLos在含有MYC過表達的CRC細胞系（圖1G）中高度表達（圖2A）。為測試MYC是否在轉錄水平調節MYCLo-1，-2和-3，作者利用熒光素酶報道分子對其進行了測定。結果表明，MYC基因抑制后，MYCLos啟動子的活性降低，表明MYC在轉錄水平上誘導MYCLos表達（圖2，L-N）。這些結果表明MYC誘導的MYCLos在轉錄水平上由轉錄增強子MYC直接調節。 3. MYC誘導的MYCLos對CDKN1A、CDKN2B等MYC靶基因細胞增殖和表達的影響
       原癌基因MYC通過調節許多細胞周期調節基因來促進細胞的增殖。作者將MYCLo-1，-2或-3以及MYC進行敲除，結果細胞增殖減少（圖3A，3B）。敲除MYCLo-1或-2導致細胞在G1期積累，表明MYCLo-1和-2參與G1 / S轉換（圖3D）。敲除MYCLo-3導致S和G2期細胞積累，表明MYCLo-3在G2期具有調節功能（圖3D）。另外作者還鑒定到有190、49和13個細胞周期調節基因分別由MYCLo-1、MYCLo-2和MYCLo-3調控（圖3E-F）。  
4. MYCLos介導的CDKN1A和CDKN2B在遠端啟動子區域的轉錄調節
        為闡明MYC調控的lncRNAs抑制CDKN1A和CDKN2B表達的機制，作者分別在CDKN1A和CDKN2B基因的啟動子中擴增了兩個不同的區域，一個包括近端MYC結合（MB）區域，另一個包括沒有MB區域的上游區域。然后利用熒光素酶實驗對擴增的區域進行啟動子測試（圖4A和B）。MYC的敲除能誘導無MB區域的上游區域的啟動子活性，敲除MYCLo-1或 -2也能誘導激活CDKN1A 和 CDKN2B的啟動子活性（圖4A,B）。表明MYC不僅在近端區域而且在其啟動子的遠端區域也可以調控CDKN1A和CDKN2B的轉錄活性。進一步見鑒定結果表明CDKN1A啟動子區域大約在2768bp和2480bp之間對MYCLo-1調節CDKN1A起關鍵的作用（圖4C），CDKN2B啟動子區域大約在840bp和570bp之間對MYCLo-2調節CDKN2B起關鍵作用（圖4D）。  
5. MYCLos和RNA結合蛋白（如HuR和hnRNPK）的相互作用
       為研究MYCLos的功能機制，作者使用RNA pull-down實驗及質譜分析的方式鑒定RNA-相關的總蛋白（圖4E,F）。結果發現10個與MYCLo-1相關的蛋白和8個與MYCLo-2相關的蛋白。通過使用RPISeq軟件進行預測，作者還發現HuR-MYCLo-1、hnRNPK-MYCLo-2具有極大相互作用的可能性（圖4G，H）。并且通過Western blot驗證其相互作用（圖4E，F）。
 
        為進一步確認HuR-MYCLo-1、hnRNPK-MYCLo-2之間的相互作用，作者利用RIP實驗進行了驗證。結果與RNA pull-down實驗結果一致，使用HuR抗體的RIP樣品中MYCLo-1獲得了富集（圖4G），使用hnRNPK抗體的RIP樣品中MYCLo-2也獲得了富集（圖4H）。這些結果表明HuR與MYCLo1的交互作用與CDKN1A的轉錄抑制有關，MYCLo-2通過與hnRNPK相互作用抑制CDKN2B的轉錄。
 
6. MYCLo-2的致癌功能
        作者利用Northern blot驗證了CRC細胞系中MYCLo-2（CCAT6）的過表達。發現大多數CRC組織中MYCLo-2具有非常高的表達水平，在52組相比較的組織樣品中有46個CRC組織的MYCLo-2高度表達（圖5A）。此外，與正常前列腺來源的細胞相比，MYCLo-2也在前列腺癌（PC）細胞和組織中過表達（圖5B, C）。在體外集落形成測定中，敲除MYCLo-2能顯著減少細胞和集落的數量，表明MYCLo-2在腫瘤細胞轉化中具有作用（圖5D）。
另外作者還通過使用MYCLo-2 siRNAs轉染腫瘤細胞的體內異種移植，研究了MYCLo-2在腫瘤發生中的抑制作用。結果表明，MYCLo-2損耗對腫瘤的發展有明顯的抑制作用（圖5E）。上述結果表明，MYCLo-2不僅在腫瘤中過表達，還參與腫瘤發生和腫瘤生長。

文章小結

該文章使用多種技術研究MYC調控lncRNAs的相關機制，揭示了MYCLos通過調節已知的MYC靶基因的表達來參與細胞增殖和細胞周期的調控，另外還發現MYCLo-1與HuR和MYCLo-2與hnRNPK之間的相互作用。進一步研究表明這些相互作用可能參與對MYC靶標（如CDKN1A和CDKN2B）的調控。此外，將MYCLo-2進行敲除能夠抑制癌細胞轉化和腫瘤發生。這些研究成果對于發現新的癌癥靶標和研究MYC相關的發病機制具有重要意義。

文獻來源