分子生物學研究尤其是人類基因組計劃的迅速發展，為適應對眾多基因或蛋白進行功能研究的發展趨勢，已出現了很多新技術，酵母雙雜交就是其中的一種。酵母雙雜交可以簡要概括為：基因轉錄所需的轉錄因子的兩個結構域在兩個互作蛋白的吸引下位置靠近，誘導了基因的表達。

 

蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎，研究反式作用因子之間的相互作用，具有其獨特優勢。

1、融合體蛋白之間的相互作用是在真核酵母細胞內進行，蛋白質保持天然的折疊狀態，蛋白質間相互作用將更接近于體內的真實水平。

2、雙雜交系統的敏感度非常高，蛋白質之間結合常數低至1mmol/L時都可以被偵測。

3、在篩選文庫時，雙雜交系統能夠得到編碼互作蛋白的基因序列，省略了其它體外檢測蛋白互作方法所必須的蛋白抽提、純化等繁瑣步驟。

 

經典的酵母雙雜交技術的建立的主要關鍵點在于酵母雙雜系統的轉錄因子和報道株。

 

一、轉錄因子

        典型的轉錄因子含有DNA結合區 (DNA-binding domain)、轉錄調控區 (activation domain)、寡聚化位點(oligomerization site) 以及核定位信號 (nuclear localization signal) 等功能區域。DNA結合區帶共性的結構主要有：1）HTH 和 HLH 結構：由兩段α-螺旋夾一段β-折疊構成，α-螺旋與β-折疊之間通過β-轉角或成環連接，即螺旋-轉角-螺旋結構和螺旋-環-螺旋結構。2）鋅指結構： 多見于 TFIII A 和類固醇激素受體中，由一段富含半胱氨酸的多肽鏈構成。每四個半光氨酸殘基或組氨酸殘基螯合一分子 Zn2+ ，其余約 12-13個殘基則呈指樣突出，剛好能嵌入 DNA 雙螺旋的大溝中而與之相結合。3）亮氨酸拉鏈結構：多見于真核生物 DNA 結合蛋白的 C 端，與癌基因表達調控有關。由兩段α - 螺旋平行排列構成，其α - 螺旋中存在每隔 7 個殘基規律性排列的亮氨酸殘基，亮氨酸側鏈交替排列而呈拉鏈狀，兩條肽鏈呈鉗狀與 DNA 相結合。

 

1、酵母雙雜系統的轉錄因子

        酵母雙雜交技術的建立要歸功于Fields對酵母轉錄因子GAL4的研究，GAL4包括兩個彼此分離的結構域.。位于N端1-147位氨基酸殘基區段的DNA結合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端768-881 位氨基酸殘基區段的轉錄激活域（Activation domain,AD)。DNA-BD能夠識別位于GAL4效應基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并與之結合。而AD則是通過與轉錄機構（transcriptionmachinery）中的其他成分之間的結合作用，以啟動UAS下游的基因進行轉    錄。DNA-BD和AD單獨分別作用并不能激活轉錄反應，但是當二者在空間上充分接近時，則呈現完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，使啟動子下游基因得到轉錄。

2、篩選方法

        酵母雙雜采用營養缺陷型的篩選方法。雙雜交系統的建立得力于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。轉錄激活因子在結構上是組件式的（modular）, 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成，其中有DNA結合結構域（DNA binding domain，簡稱為BD）和轉錄激活結構域（activation domain，簡稱為AD），它們是轉錄激活因子發揮功能所必需的。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉錄激活結構域定位于所調節的基因的上游，轉錄激活結構域可同轉錄復合體的其他成分作用，啟動它所調節的基因的轉錄。兩個結構域不但可在其連接區適當部位打開，仍具有各自的功能。酵母雙雜交系統利用雜交基因激活報道基因的表達，探測蛋白－蛋白的相互作用。單獨的BD雖然能和啟動子結合，但是不能激活轉錄。而不同轉錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉錄的功能。如酵母細胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個酸性激活結構域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結合到Gal4結合位點并激活轉錄。

 

二、報道株

       雙雜交系統的另一個重要的元件是報道株。報道株指經改造的、含報道基因（reporter gene）的重組質粒的宿主細胞。最常用的是酵母細胞，酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統具有許多優點：1）易于轉化、便于回收擴增質粒。2）具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因。3）酵母的內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結合。激活結構域融合基因轉入表達結合結構域融合基因的酵母細胞系中，蛋白間的作用使得轉錄因子重建導致相鄰的報道基因表達（如lacZ）， 從而可分析蛋白間的結合作用。

 

       說了這么多，其實酵母雙雜交并不止這一種模式，經過科學家的不斷努力和創新，現在常用的酵母雙雜交系統還有基于分離的泛素的膜蛋白酵母雙雜交及基于Ras信號通路的酵母雙雜系統。

 

        基于分離的泛素的膜蛋白酵母雙雜交系統的基本思路和上文介紹的經典系統基本一致，只是將互作的場所搬到了細胞膜上，由于涉及到膜蛋白的方向性，在載體選擇和實驗設計上較經典模式更復雜。

 

        基于Ras信號通路的酵母雙雜系統使用的是酵母細胞的溫度敏感型菌株，利用的是蛋白的互作激活Ras信號通路才能使酵母細胞在低溫下存活的思路。

 

        酵母雙雜交系統能在體內測定蛋白質的結合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達。②信號測定是在自然平衡濃度條件下進行，而免疫共沉淀等物理方法為達到此條件需進行多次洗滌，降低了信號強度。③雜交蛋白穩定度可被激活結構域和結合結構域結合形成轉錄起始復合物而增強，后者又與啟動子DNA結合，此三元復合體使其中各組分的結合趨于穩定。④通過mRNA產生多種穩定的酶使信號放大。同時， 酵母表型、X-Gal及HIS3蛋白表達等檢測方法均很敏感。

酵母雙雜交技術以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質之間在活細胞內的相互作用等特點，在蛋白互作的研究中將得到更為廣泛的應用。

 

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