題目：CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency

期刊：Cell stem cell

影響因子：23.394

主要技術：CRISPR-dCas9-VP64激活系統、誘導性多能干細胞構建、原代細胞制作、iPS鑒定

研究背景

        終末分化的成體細胞逆分化，形成多能干細胞狀態的過程稱為細胞重編程（Cell reprogramming）。在2006年，日本科學家山中伸彌（Shinya Yamanaka）發表誘導性多能干細胞（iPS, induced pluripotent stem cells）構建技術，利用逆轉錄病毒，把OSKM（OCT4, SOX2,KLF4 and C-myc）四因子在體細胞中進行超表達，成功把小鼠胚胎成纖維細胞誘導形成多能干細胞，開辟了一個全新的干細胞研究領域。隨著研究的深入，人皮膚成纖維細胞、T淋巴細胞等也被成功誘導成多能干細胞。而這些多能干細胞與供體DNA是保持一致的，且有分化成多種細胞的潛力，展現出非常廣闊的臨床應用前景。如把人血液中的T淋巴細胞逆分化形成多能干細胞后，當定向分化技術成熟時， iPS能被有序分化成需要的細胞，比如心肌細胞、神經細胞等。

        染色體上重要的基因啟動子位點的表觀遺傳學變化，如DNA甲基化水平變化、組蛋白乙酰化水平變化、染色質重塑等，開啟重要基因如OCT4, SOX2等的內源性表達，是iPS誘導過程中至關重要的事件，直接關系到誘導是否成功。

        CRISPR-Cas9系統作為一種強大的基因編輯工具，現今已廣泛用于常規的細胞或者個體的基因敲除、基因敲入、點突變外。當CAS9蛋白進行失活改造以及結構域添加后，得到CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統，則能實現特異基因轉錄激活。CRISPR-dCas9內源基因激活技術（SunTag Gene Activation），正好與iPS誘導技術完美契合，解決了激活內源OSKM四基因的問題，從而誕生了新型的iPS構建策略（見圖1）。

              

圖1. 利用CRIPR-dCas9基因激活系統的iPS誘導策略                   

 

研究內容及結果

1. 設計定位于Sox2和Oct4基因啟動子區和Oct4增強子區的sgRNA，利用CRISPR-dCas9-SunTag-VP64對Sox2和Oct4進行激活。

        本研究首先設計了相應基因靶標的SgRNA，啟動子區或者增強子區靶標位置考慮因素包括：sgRNA靶標位置與重要的轉錄因子（OCT4、SOX2、NANOG）結合位點、組蛋白乙酰轉移酶p300結合位點的距離，靶標區附近組蛋白乙?；植?、DNA甲基化分布等。并以MEF細胞為材料，在RNA水平檢測了不同sgRNA對靶標基因sox2和oct4的激活效果（圖2）。

                 

圖 2. MEF細胞中，Sox2和Oct4基因啟動子區和Oct4增強子區不同sgRNA的轉錄激活效果驗證實驗          

 

2. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統對重要基因進行內源激活，能成功獲得iPS.

        隨后，同樣使用此方法，利用篩選出來18個有效sgRNA，分別激活7個重要基因: Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nr5a2, Glis 1, Cebpa。將MEF利用病毒感染方法進行18 sgRNA導入后，與dCas9-SunTag-VP64形成復合體，激活了OG2-MEF中相應內源基因的表達，經過17天的誘導后，成功得到了iPS細胞，并穩定傳代，且顯示出與胚胎干細胞相同的克隆形態。通過免疫熒光和QPCR，顯示得到的iPS表達Nanog, Sox2和SSEA-1，相關干細胞基因表達水平與RI胚胎干細胞相比，均相當或者超過。此部分證明CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統進行內源激活時，能成功實現iPS誘導（圖3）。

圖3. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統同時激活Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nr5a2, Glis 1, Cebpa內源表達時，能成功實現iPS誘導                           

 

3. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統單獨對Sox2基因進行內源激活，也能有效獲得iPS

        研究者單獨選取了能對Sox2進行激活的SgRNA進行iPS誘導，發現在有效激活內源Sox2基因表達的情況下，能成功得到誘導性多能干細胞，并能穩定增殖傳代。得到iPS通過體內體外實驗，如干細胞基因表達情況檢測實驗（免疫熒光、qPCR等）、囊胚注射實驗等，在囊胚注射實驗后，還得到了嵌合體小鼠，并能穩定地生殖傳遞，后代中得到OG2小鼠品系的小鼠。這些實驗證明了iPS細胞系的完整干性：穩定自我更新能力和多向分化能力（圖4）。

                  

圖4. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統單獨激活Sox2內源表達時，能成功實現iPS誘導     

 

4. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統同時對Oct4基因啟動子區和增強子區進行內源激活，能有效獲得iPS

        接下來，研究者選取靶標位置為Oct4啟動子區或者增強子區的sgRNA進行誘導實驗，發現單獨利用Oct4啟動子區的sgRNA或者增強子區sgRNA對Oct4基因進行激活時，雖然表達激活，但內源強度無法得與胚胎干細胞系R1相比。在誘導過程中，單獨的sgRNA無法得到iPS。Oct4啟動子區的sgRNA或者增強子區sgRNA進行組合時，內源Oct4表達強度得到了很好的提升，最終得到iPS，并能穩定增殖傳代。得到iPS通過體內體外實驗，如干細胞基因表達情況檢測實驗（免疫熒光、qPCR等）、囊胚注射實驗等，在囊胚注射實驗后，還得到了嵌合體小鼠，并能穩定地生殖傳遞，后代中得到OG2小鼠品系的小鼠。這些實驗證明了iPS細胞系的完整干性：穩定自我更新能力和多向分化能力（圖5）。

                  

圖 5. CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統同時對Oct4基因啟動子區和增強子區進行內源激活能有效獲得iPS                                         

 

文章小結

        作為利用CRISPR-dCas9激活系統進行iPS構建，作者非常有力地證明了CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統對構建iPS的有效性?？梢灶A見，后續的MEF直接誘導形成心肌細胞、神經細胞的研究中，此系統很可能也有一席之地。此文章既進行了相關技術方法探索，也回答了一個非常好的科學問題：iPS誘導過程中，相關內源基因的表觀遺傳學變化直觀重要。

在表觀遺傳學研究中，CRIPSR-dCas9激活內源基因表達的應用，會相對廣泛一些。CRISPR-dCas9-SunTag-VP64系統稍加改進，很可能是直接改變相關基因表觀遺傳學特征的利器。

 

解析文獻

P. Liu, M. Chen, Y. Liu, L.S. Qi, S. Ding. CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency, Cell stem cell, 22 (2018) 252-261.
 

 

參考文獻

1. Black, J. B., Adler, A. F., et al. (2016) Targeted Epigenetic Remodeling of Endogenous Loci by CRISPR/Cas9-Based Transcriptional Activators Directly Converts Fibroblasts to Neuronal Cells. Cell stem cell 19, 406-414

2Chakraborty, S., Ji, H., Kabadi, A. M., et al. (2014) A CRISPR/Cas9-based system for reprogramming cell lineage specification. Stem cell reports 3, 940-947

3. Chavez, A., Scheiman, J., et al. (2015) Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature methods 12, 326-328

4. Thakore, P. I., D'Ippolito, A. M., et al. (2015) Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature methods 12, 1143-1149

5. Buganim, Y., Faddah, D. A., et al. (2012) Single-cell expression analyses during cellular reprogramming reveal an early stochastic and a late hierarchic phase. Cell 150, 1209-1222

6.Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676