噬菌體展示技術經過近20年的發展和完善，已被廣泛應用于抗原抗體庫的建立、藥物設計、疫苗研究、病原檢測、基因治療、抗原表位研究及細胞信號轉導研究等。噬菌體展示系統模擬了自然免疫系統，使我們有可能模擬體內抗體生成過程，構建高親和力抗體庫。由于噬菌體展示技術實現了基因型和表型的有效轉換，使研究者在基因分子克隆基礎上實現了蛋白質構象體外控制，從而為獲取具有良好生物學活性的表達產物提供了強有力手段。另外，噬菌體展示技術已成為不經過免疫獲取特異性人源抗體的新途徑，為獲取對人類和動物疾病有診斷和治療價值的單克隆抗體提供了重要手段。

        應用面這么高大上，那么原理到底是什么呢？那接下來將由小編為您揭開其神秘的面紗！ 

 

一、 噬菌體展示技術的原理

噬菌體展示技術（phage display）是將多肽或蛋白質的編碼基因插入噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。展示到噬菌體表面的多肽或蛋白保持相對獨立的空間結構和生物活性，可以與靶分子結合和識別。噬菌體展示的肽庫或蛋白庫與固相抗原結合，洗去未結合的噬菌體，然后用酸堿或者競爭的分子洗脫下結合的噬菌體，中和后的噬菌體感染大腸桿菌擴增，經過3-5輪的富集，逐步提高可以特異性識別靶分子的噬菌體比例，最終獲得識別靶分子的多肽或者蛋白。下圖粗略展示了技術篩選的過程： 

 

二、噬菌體展示系統的分類

1.M13噬菌體展示系統

       M13噬菌體屬于單鏈環狀DNA病毒，其基因組為6.4 kb，編碼10種蛋白，其中5種為結構蛋白，包括主要衣殼蛋白的PⅧ 和次要衣殼的pⅢ 、pⅥ 、PⅦ 和PⅨ 。其中，pⅢ 和PⅧ 是噬菌體展示中最常用的兩種蛋白，構建了pⅢ 和PⅧ 展示系統。pⅢ 蛋白分子量為42 kDa，分布在噬菌體顆粒的一端。一般一個噬菌體有3-5個拷貝的pⅢ 蛋白，可在N端的柔性連接區插入外源蛋白或者多肽。pⅢ 系統的主要優點是對展示的外源蛋白大小無嚴格的要求，該系統可以用來展示分子量較大的蛋白。PⅧ 蛋白的分子量為5.2 kDa，主要分布在噬菌體顆粒的兩側。由于該蛋白的分子量很小，只適合用來展示外源短肽。外源肽段的太大會影響病毒包裝，不能形成有功能的噬菌體。但由于pⅢ蛋白拷貝數較多，該系統比較適合用來篩選低親和力的配體。

2.λ噬菌體展示系統

        λ噬菌體是長尾噬菌體科的一種溫和噬菌體，有直徑55nm的二十面體頭部，末端有細長尾絲?；蚪M為48.5 kb的線性雙鏈DNA分子，有黏性末端即單鏈延伸12個核苷酸，感染后線性基因組可立即環化。噬菌體的頭部由D蛋白和V蛋白構成，可以構建D蛋白和V蛋白的展示系統。λ噬菌體是在宿主細胞內完成裝配的，無需將外源肽或蛋白分泌到細菌胞膜外，可展示有活性的大分子蛋白質(100 kDa以上蛋白質)及宿主細胞有毒性的蛋白質，適用范圍極廣。

 

3. T4噬菌體展示系統

        T4 噬菌體基因組DNA 為雙鏈線形，呈環狀排列，噬菌體衣殼的有兩種非必需外殼蛋白：SOC(small outer capsid protein)和HOC(highly antigenic outer capsid protein)。T4 噬菌體表面展示是將外源多肽或蛋白質分別與SOC位點的C末端和HOC 位點的N末端融合而展示于T4 噬菌體表面。T4噬菌體的主要優點是可以實現SOC位點和HOC位點同時展示，展示的拷貝數也較多。

 

4. T7噬菌體展示系統

        T7 噬菌體基因組為線性雙鏈DNA，其衣殼蛋白通常有兩種形式，即10A(344個氨基酸殘基)和10B(397個氨基酸殘基)，10B衣殼蛋白區存在于噬菌體表面，所以被用來構建噬菌體展示系統。T7噬菌體展示系統可以高拷貝展示50個氨基酸的多肽，以低拷貝量(0.1-1/噬菌體)或以中拷貝量(5-15/噬菌體)展示1200個氨基酸殘基的多肽或蛋白質。因此，廣泛應用于篩選不同分子量，不同親和力的蛋白質。

三、噬菌體展示技術的應用

1. 抗體篩選

        將抗體可變區的基因插入噬菌體基因組中，表達的抗體展示到噬菌體的表面，構建噬菌體展示抗體庫，可以在體外模擬抗體生成的過程，篩選針對任何抗原的抗體。相對于雜交瘤技術，通過噬菌體展示抗體庫技術篩選抗體，可以不經過免疫，縮短抗體生產的周期。也可以篩選在體內免疫原性弱，或者有毒性的抗原的抗體，適用范圍廣。噬菌體展示抗體庫技術不受種屬的限制，可以構建各種物種的抗體庫。從人天然庫中篩選到的抗體，可以不經過人源化過程，直接用于抗體藥物研究。

 

2. 新受體和配體的發現

        將隨機多肽序列展示到噬菌體的表面，獲得噬菌體展示多肽庫。用細胞作為篩選靶標，經過差異篩選，獲得出識別特定細胞的多肽。通過研究該多肽序列，可以進一步得到細胞表面特異性表達的受體蛋白。用HCT116細胞篩選12肽庫，從庫中篩選出了可以特異性行識別結腸癌細胞的多肽。進一步分析分析發現，該多肽可以特異性識別a-enolase。該蛋白有望作為結腸癌治療的靶標，篩選結腸癌治療藥物。獲得的多肽序列，也可以作為抗癌藥物的運送載體。

 

3. 蛋白質相互作用研究

        蛋白質的相互作用是生命過程中所不可缺少的，噬菌體展示的多肽文庫是由特定長度的隨機短肽序列組成。用靶蛋白質(如受體)對該隨機文庫進行親和淘選，就可以獲得與之結合的短肽序列。對所得序列測序分析，并合成相應的短肽，從而可以來研究兩個蛋白質之間的相互作用。利用這種方法已經成功鑒定出多個重要大分子，如生長激素受體、胰島素受體、胰島素樣生長因子受體和TNF-a 受體的激動劑和頡頏劑等。

 

4. 抗原表位分析

        用抗體作為篩選的蛋白，從噬菌體展示的隨機多肽庫中，篩選出可以與抗體特異性結合的噬菌體，經測序分析，獲得該抗體識別的抗原表位。該技術為抗原抗體反應機制研究，診斷試劑開發，疫苗制備等提供依據。

目前的表位鑒定技術能夠實現：

①單抗藥物及診斷用單抗的制備；

②研制包括“通用”目標在內的治療性和預防性重組多價肽疫苗；

③研制單表位或重組多表位肽檢測抗原；

④篩選基于表位基序的疾病、腫瘤等新的特異診斷標志物；

⑤高通量發現同源蛋白中全部保守性和特異性表位；

⑥篩選功能性抗體表位或者抗體中和性及可及性表位；

⑦為表位水平分析病毒遺傳進化和變異，提供抗原漂移和轉移的直接證據。

 

5. 抗體人源化改造

        單抗人源化比例不斷升高，單抗的藥物靶位逐漸多樣化，除了傳統的細胞表面抗原，還包括了常見的細胞因子，部分研制中的單抗藥物甚至可以識別多個抗原表位，而且單抗藥物的結構也不限于完整的單抗分子。聯合小分子等的治療方案逐漸增加，日益受到醫療工作者的重視。因此，作為一種高科技含量的藥物，單抗藥物企業的科技水平決定了其競爭力，也決定了藥物的治療效果和市場價值。

 

6. 雙特異性抗體（BsAb）制備

        通過基因工程手段將兩個分別靶向不同抗原的抗體片段組合在一起，具有兩種抗原結合位點，可以發揮協同作用，進而提高治療效果。但是雙特異性抗體的種類較多，選擇時根據最終的應用來做判斷。

 

7. 酶抑制劑篩選

        β- 酮脂酰-ACP 還原酶是原核生物脂肪酸生物合成代謝中高度保守和廣泛存在的酶，用此蛋白為篩選的靶蛋白，從噬菌體肽庫中篩選出了該酶的抑制劑，可以作為新型的抗菌劑。已針對乙酰膽堿酯酶、海藻糖酶、乙酰乳酸合成酶、乙酰CoA 羧化酶和谷氨酰胺合成酶等靶標酶，開發和研制了一系列高效的殺蟲劑和除草劑。

 

8. 蛋白質的定向改造

        蛋白質的定向改造是指用盒式突變、錯誤傾向PCR等方法來突變蛋白質或者結構域的某一特定編碼序列，產生蛋白質或結構域的突變文庫呈現在噬菌體表面，通過親和篩選獲得所需的已定向改變的噬菌體克隆，他們的一級結構可以從DNA的序列中推導出來，可用來篩選具有更強受體結合能力的細胞因子、新的酶抑制劑、轉錄因子的DNA結合新位點、新的細胞因子拮抗劑、新型酶和增強生物學活性的蛋白質等。

 

三、金開瑞噬菌體展示定制服務類型

1. 天然/免疫抗體庫構建（人、小鼠、兔、羊駝等）

2. 抗原表位鑒定 

3. 蛋白質相互作用研究

4. 抗體篩選

5. 抗體人源化

6. 抗體親和力成熟

7. 重組抗體改造
 

        武漢金開瑞生物工程有限公司引進了成熟先進的噬菌體庫篩選專利技術，并通過多年積累的經驗，不斷優化篩選方案，極大的提高了實驗的精確度，為很多藥企及科研單位都交付了非常滿意的答卷，金開瑞強大的噬菌體團隊已經建立了一個綜合的抗體藥物研發平臺，從抗體的發現、到抗體測序、工程化改造到大規模制備，完美地整合抗體生產和抗體工程技術，以滿足客戶單克隆抗體藥物研發及科研生產的需要，隨著該技術的不斷發展和創新，該技術的應用范圍和能力將會得到更大的發展，在這條道路上，您并不孤單，武漢金開瑞金開瑞生物工程有限公司將會與您攜手同行，盡最大能力助您一臂之力！

 

參考文獻：

Azzazy, H. M. and W. E. Highsmith, Jr. (2002). "Phage display technology: clinical applications and recent innovations." Clin Biochem 35(6): 425-445.

Dai, M., J. Temirov, E. Pesavento, C. Kiss, N. Velappan, P. Pavlik, J. H. Werner and A. R. Bradbury (2008). "Using T7 phage display to select GFP-based binders." Protein Eng Des Sel 21(7): 413-424.

Dunn, I. S. (1995). "Assembly of functional bacteriophage lambda virions incorporating C-terminal peptide or protein fusions with the major tail protein." J Mol Biol 248(3): 497-506.

Kristan, K., T. Bratkovic, M. Sova, S. Gobec, A. Prezelj and U. Urleb (2009). "Novel inhibitors of beta-ketoacyl-ACP reductase from Escherichia coli." Chem Biol Interact 178(1-3): 310-316.

Pande, J., M. M. Szewczyk and A. K. Grover (2010). "Phage display: concept, innovations, applications and future." Biotechnol Adv 28(6): 849-858.

Paschke, M. (2006). "Phage display systems and their applications." Appl Microbiol Biotechnol 70(1): 2-11.

Ren, Z. J., G. K. Lewis, P. T. Wingfield, E. G. Locke, A. C. Steven and L. W. Black (1996). "Phage display of intact domains at high copy number: a system based on SOC, the small outer capsid protein of bacteriophage T4." Protein Sci 5(9): 1833-1843.

Smith, G. P. (1985). "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface." Science 228(4705): 1315-1317.

Sun, S., K. Kondabagil, B. Draper, T. I. Alam, V. D. Bowman, Z. Zhang, S. Hegde, A. Fokine, M. G. Rossmann and V. B. Rao (2008). "The structure of the phage T4 DNA packaging motor suggests a mechanism dependent on electrostatic forces." Cell 135(7): 1251-1262.

Wu, C. H., Y. H. Kuo, R. L. Hong and H. C. Wu (2015). "alpha-Enolase-binding peptide enhances drug delivery efficiency and therapeutic efficacy against colorectal cancer." Sci Transl Med 7(290): 290ra291.

Yang, F., P. Forrer, Z. Dauter, J. F. Conway, N. Cheng, M. E. Cerritelli, A. C. Steven, A. Pluckthun and A. Wlodawer (2000). "Novel fold and capsid-binding properties of the lambda-phage display platform protein gpD." Nat Struct Biol 7(3): 230-237.

 

1. Azzazy, H. M. and W. E. Highsmith, Jr. (2002). Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clin Biochem 35(6): 425-445.

2. Dai, M., J. Temirov, et al. (2008). Using T7 phage display to select GFP-based binders. Protein Eng Des Sel 21(7): 413-424.

3. Dunn, I. S. (1995). Assembly of functional bacteriophage lambda virions incorporating C-terminal peptide or protein fusions with the major tail protein. J Mol Biol 248(3): 497-506.

4. Kristan, K., T. Bratkovic, et al. (2009). Novel inhibitors of beta-ketoacyl-ACP reductase from Escherichia coli. Chem Biol Interact 178(1-3): 310-316.

5. Pande, J., et al. (2010).Phage display: concept, innovations, applications and future.Biotechnol Adv 28(6): 849-858.

6. Paschke, M. (2006). Phage display systems and their applications. Appl Microbiol Biotechnol 70(1): 2-11.

7. Ren, Z. J., G. K. Lewis, et al. (1996).Phage display of intact domains at high copy number: a system based on SOC, the small outer capsid protein of bacteriophage T4. Protein Sci 5(9): 1833-1843.

8. Smith, G. P. (1985).Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science 228(4705): 1315-1317.

9. Sun, S., K. Kondabagil, et al. (2008). The structure of the phage T4 DNA packaging motor suggests a mechanism dependent on electrostatic forces. Cell 135(7): 1251-1262.

10. Wu, C. H., et al. (2015). alpha-Enolase-binding peptide enhances drug delivery efficiency and therapeutic efficacy against colorectal cancer. Sci Transl Med 7(290): 290ra291.

11. Yang, F., P. Forrer, et al. (2000). Novel fold and capsid-binding properties of the lambda-phage display platform protein gpD. Nat Struct Biol 7(3): 230-237.