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RNA pull down—研究RNA與蛋白互作的法寶

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2018-05-10 14:35:15

RNA與蛋白質(zhì)的相互作用是細(xì)胞生理過程得以實(shí)現(xiàn)的決定性因素之一。近年來，隨著技術(shù)的改進(jìn)和新方法的建立，RNA和蛋白質(zhì)的相互作用研究取得了長足進(jìn)步。目前科研人員已經(jīng)鑒定了較多RNA上的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，也發(fā)現(xiàn)了許多蛋白質(zhì)中的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并對它們的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了比較詳細(xì)的研究。這些為最終探明RNA和蛋白質(zhì)相互作用的分子機(jī)制，從而從本質(zhì)上認(rèn)識相關(guān)的細(xì)胞生理過程打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

RNA pull-down作為研究RNA與蛋白互作的核心技術(shù)，已成為研究焦點(diǎn)。RNA pull down是使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過WB實(shí)驗(yàn)檢測特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用，或者結(jié)合MS篩選RNA結(jié)合的未知蛋白。

RNA pull down技術(shù)應(yīng)用

1.癌癥腫瘤相關(guān)調(diào)控機(jī)制研究

LncRNA發(fā)揮功能的方式很廣，可以與蛋白、DNA和RNA相互作用，參與多種生物學(xué)過程的調(diào)控。主要包括基因組表觀遺傳修飾、調(diào)控轉(zhuǎn)錄后翻譯、發(fā)揮ceRNA、增強(qiáng)子RNA作用等，從而對細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡、免疫等發(fā)揮調(diào)控作用。

lncRNA能夠通過對腫瘤細(xì)胞糖代謝、谷氨酰胺代謝和脂類代謝途徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)節(jié)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對葡萄糖攝取增加、谷氨酰胺分解增強(qiáng)及脂質(zhì)生成增加，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前，大多數(shù)lncRNA在腫瘤細(xì)胞能量代謝中的功能和調(diào)控機(jī)制尚不完全清楚，進(jìn)一步認(rèn)識和了解腫瘤細(xì)胞中與lncRNA相關(guān)的能量代謝異常表現(xiàn)出的惡性生物學(xué)行為，將有助于為腫瘤的診斷和治療提供有效的證據(jù)及新的思路和途徑。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是近來研究很熱門的一種特殊的長鏈非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 在人體細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄后水平具有調(diào)控基因表達(dá)的重要功能，并且參與多種腫瘤和其他疾病的病理發(fā)展過程

circRNA大多由外顯子序列組成，呈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，性質(zhì)穩(wěn)定，高度保守性，通過微小RNA“海綿”作用調(diào)控靶基因表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。這些特性使circRNA有潛力成為腫瘤新型分子診斷標(biāo)志物。通過競爭性與腫瘤相關(guān)微小RNA的結(jié)合，可以開發(fā)針對circRNA分子靶點(diǎn)的靶向治療藥。因此,circRNA在腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中意義巨大。

2.多種人類疾病研究

RBPs在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控mRNA穩(wěn)定性、LncRNA活性、應(yīng)激、腫瘤發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞凋亡等眾多生物學(xué)過程，且與諸多人類疾病密切相關(guān)。因此，對RBPs-RNAs相互作用網(wǎng)絡(luò)的研究和鑒定有重要意義。但由于RBPs作用方式復(fù)雜、功能多樣性、作用空間位置多樣化等原因，對其開展精確研究一直是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。RNA領(lǐng)域，尤其是非編碼RNA研究的快速發(fā)展，催生了多種RBPs-RNAs相互作用鑒定技術(shù)。

問題	原因	解決方案
RNA結(jié)合蛋白的親和力不夠	1）結(jié)合緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化 2）裂解不完全 3）磁珠用量不足 4）RNA探針用量不足	1）優(yōu)化孵育時(shí)間、溫度、鹽濃度等條件 2）增加裂解液和蛋白上樣量的比例 3）增加裂解液 4）增加磁珠或探針用量 5）確定生物素和鏈霉親和素效率
RNA結(jié)合蛋白沒有結(jié)合	1）靶蛋白量不足 2）緩沖體系不對 3）RNA探針和蛋白的親和力本來就低	1）增加上樣蛋白量 2）應(yīng)用低鹽體系 3）加入交聯(lián)試劑
WB信噪比高	1）陽性信號率低 2）一抗效率低 3）蛋白沒有充分溶解	1）增加二抗的量 2）用敏感度的化學(xué)發(fā)光液 3）用細(xì)胞裂解液預(yù)孵一抗 4）增加樣品的量 5）確定有沒有其他可能的結(jié)合情況 6）增加裂解液用量
結(jié)合的非特異性高	1）緩沖環(huán)境沒有優(yōu)化 2）緩沖環(huán)境嚴(yán)謹(jǐn)性低 3）樣品沒有裂解完全和裂解體系沒有優(yōu)化	1）優(yōu)化孵育時(shí)間溫度鹽濃度等條件 2）使用嚴(yán)謹(jǐn)性高的緩沖體系 3）調(diào)低RNA探針和樣品的比例 4）提高裂解液的量

案例展示

案例一

題目：The STAT3-Binding Long Noncoding RNA lnc-DC Controls Human Dendritic Cell Differentiation

小結(jié)：RNA pull-down設(shè)置實(shí)驗(yàn)組及反義鏈對照組，銀染找出差異條帶進(jìn)行膠條質(zhì)譜鑒定，分析結(jié)果篩選得到STAT3蛋白，進(jìn)一步通過RIP-qPCR反向驗(yàn)證，證實(shí)STAT3蛋白可以與lnc-DC結(jié)合。

Lnc-DC pull-down銀染檢測及RIP驗(yàn)證Lnc-DC與STAT3互作

案例二

題目：The long noncoding RNA THRIL regulates TNFα expression through its interaction with hnRNPL

小結(jié)：先用Linc1992全長進(jìn)行RNA pull-down實(shí)驗(yàn)，通過WB檢測手段分析四個(gè)意向蛋白中篩選得到一個(gè)差異蛋白α-hnRNPL，通過分段RNA pull-down及WB分析核心結(jié)合區(qū)域，主要是Linc1992的1-699和1406-2012區(qū)域，通過RIP-qPCR反向驗(yàn)證，證明α-hnRNPL蛋白可以與Linc1992結(jié)合。