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教你使用譜圖標峰小工具—pLabel

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2023-02-22 09:38:01

在LC-MS/MS蛋白質鑒定實驗中，由于化學污染、電氣噪聲、低質量的準確性，以及意料之外的翻譯后修飾（PTM）和MS / MS碎片模式，使用搜索引擎進行大批量解析譜圖過程，可能導致肽段鑒定結果存在大量假陽性。另外，搜索引擎算法上存在的缺陷也會造成肽段-譜圖匹配（Peptide Spectrum Maches，PSMs）的錯誤。因此，人工驗證PSMs質量成為必要，尤其對于特定的研究目的（如多肽鑒定，目標蛋白識別等）或特定蛋白，這時候就需要我們用自己的火眼金睛來判斷譜圖與給定肽段序列的匹配情況了。除此之外，有些雜志也要求提供特定肽段的PSM峰圖。

今天給大家推薦一款關于譜圖標峰實用的小工具——pLabel，并手把手教會大家如何使用。

1. pLabel介紹

pLabel™ （當前版本，v2.4.05）是一款專門用于蛋白質組學研究的質譜峰標注軟件（mass spectral peak labeling software）。主要提供如下功能：

1）支持批處理，質譜數據和搜索引擎的搜索結果可同時直接導入；

2）支持多種質譜數據格式（mgf，dta，ms2），搜索引擎檢索結果（pFind，Mascot，SEQUEST）；

3）支持ECD/ETD碎裂模式的譜圖標峰；

4）根據用戶定制的片段離子類型，在已知的PSM中突出顯示不同顏色的匹配峰（如b離子峰為綠色、y離子峰為紅色）

5）可同時實現多個氨基酸位點，多種翻譯后修飾的標峰；

6）支持中性缺失標峰功能；

7）支持相關統計功能；

8）輸出圖片支持多種格式（png，bmp，tiff，jpg），可以單張導出或批量導出。

2、資源獲取及安裝

從下面鏈接下載Find軟件：http://pfind.org/software/pLabel/。解壓后找到plabel文件夾，找到plabel.exe，然后雙擊，開始安裝。注意，pLabel目前只支持Windows環境系統。

3、軟件使用

1）質譜原始文件導入（step1）

本文以MGF格式文件為例(gel_ID_002_MGFPeaklist.mgf)：

? 打開軟件，導航欄單擊FILE按鈕；

? Load MS/MS File→選擇MGF格式類型→導入MGF文件。

Step 1. MGF文件導入

這一步相當于將對應mgf文件中的所有二級譜圖導入了plabel中。

2）查看所有譜圖和指定譜圖

? 點擊界面右側的All按鈕，會彈出mgf文件中的所有二級譜圖的title

? 在彈出的界面中選擇一個，或者在左下角輸入所關注的二級譜的title，然后點擊確定，此時plabel界面就會顯示對應的二級譜圖。例如，本文想觀察譜圖編號為1.1.1.1109.3的二級譜。關于怎么知道所關心的譜圖編號（或title），請繼續往下看。

Step2. 選擇特定譜圖

3）選擇特定譜圖-肽段，并對其進行譜峰標注

本文以Proteinpilot結果為例（如圖1）。譜圖編號為1.1.1.1164.6，肽段序列為LDSELKNMQDMVEDYR，可變修飾為8號氨基酸的Oxidation(M)和11號氨基酸的Oxidation(M)。

? 按照2）步驟選擇譜圖1.1.1.1164.6。

? 將肽段LDSELKNMQDMVEDYR復制粘貼到界面左下角的SEQ欄。

? 設置參數。勾選Show Info，勾選Show Peak Mass，勾選Show Neutral Loss，勾選Show AA sequence，TOL：0.1，Threshold：1.0。其它參數默認。

? 在對應位點添加可變修飾（單擊左上角的mod選項）。

? 點擊Update。此時界面出現了譜圖的標峰圖

? 右擊圖片界面空白處（圖2），保存圖片。

? 至此，對特定譜圖-肽段的的標峰完成了。

圖. ProteinPilot軟件輸出結果示例

Step3. 譜圖肽段標峰

標注的譜峰圖

4）高級設置

自定義需要標注的碎片離子類型

默認下，plabel只標注-b和-y系列離子。我們可以根據質譜儀的型號與采集模式標注其他類型碎片離子。方法如下（step4）：

? 點擊下方導航欄中的Ion Type Select按鈕；

? 選擇需要添加的離子類型。對大多數質譜儀將肽段母離子碎裂成b、y系列離子（一價或二價），并且有中性丟失的情況發生。因此，我們添加b、y的中性丟失；

? 點擊下方導航欄的Main info返回設置主界面。點擊Updat，會發現在標峰圖中多了相應的譜圖標注信息。

Step4. 選擇其他類型的碎片離子

自定義修飾類型

有時候，默認的plabel中的修飾類型不包含想要添加的類型。這時候就需要我們自己動手添加了。以譜圖1.1.1.1114.2和對應的肽段AQYEDIAQK為例，其修飾類型為：Methyl(D)@5; Formyl(K)@9。發現默認的plabel中沒有這兩個修飾。在添加新修飾類型之前我們需要確定以下信息：修飾基團的分子量（單一同位素分子量和平均同位素分子量）、修飾位點和中性缺失。這些信息可以直接在對應的搜索引擎中尋找，也可以到unimod官網上查看（http://www.unimod.org/modifications_list.php），如下，

Unimod查找：

? 進入網頁，以guest身份登錄；

? 將修飾名稱（Methyl）輸入到搜索欄，點擊Search按鈕；

? 在出現的結果中找到Methyl，ID為34，點擊View進入該修飾界面；

? 可以看到，Methyl修飾的化學式為H(2)C，單一同位素（Monoisotopic）分子量為14.015650，平均同位素(Average)分子量為14.0266，無中性丟失。可發生Methyl修飾的氨基酸包括C,H,K,N,N-term,Q,R,I,L等。

將Methyl修飾添加到plabel中（step5）：

? 按照前述步驟選擇譜圖1.1.1.1114.2，輸入肽段AQYEDIAQK

? 點擊plabel上方主導航欄中的ion按鈕；

? 選擇Mass Config→Modification→Add，此時會彈出添加修飾類型的小窗口；

? 添加自定義修飾。Name為自定義名字，最好能夠顧名思義，以方便以后使用。本示例輸入Methyl（D）；Site為發生修飾的位點，輸入D；Modification Type為修飾類型，為NORMAL；Mass（Mono）：14.015650，Mass（Avrg）：14.0266。點擊OK保存；

? 同樣的方法添加Formyl（K）修飾；

? 按前述步驟將Methyl(D)@5; Formyl(K)@9添加到序列中。