蛋白質組學技術在農業(yè)生物科研領域、疾病機理機制研究、藥物研究、海洋環(huán)境、植物脅迫機制研究等方面具有廣泛應用。蛋白組學的研究通常遵循以下思路：

   圖 1 蛋白質組學研究思路                                

一、蛋白質組學在農業(yè)生物科研領域的應用

        蛋白質組學技術在農業(yè)生物科研領域的應用為作物生長發(fā)育、病蟲害防治、遺傳育種、畜牧獸醫(yī)學疾病診斷和治療等方面發(fā)揮重要的作用，為現代農業(yè)發(fā)展開辟新途徑。

1 .蛋白質組學在農作物研究中的應用

        農業(yè)是我國人口賴以生存的基礎，而提高糧食產量和品質則是農業(yè)發(fā)展的關鍵。蛋白質組學關鍵技術在作物遺傳育種、品系鑒定、品質改良、逆境脅迫應答等關鍵環(huán)節(jié)的應用，為農業(yè)作物的進一步開發(fā)利用提供巨大的參考價值。蛋白質組學可系統研究農作物在特定環(huán)境或某個發(fā)育階段的組織和器官中蛋白質的表達變化，有助于作物發(fā)育過程機制的理解。

        Jia等人利用SWATH等技術對四種玉米組織中的蛋白質進行定量分析：包括未成熟雌穗，未成熟雄穗，授粉后20天的幼胚和14日齡幼苗的根。在玉米的4種組織中總共鑒定到4551個蛋白質，其中在雌穗，雄穗，幼胚和幼根中分別鑒定到3916、3707、3702和2871種蛋白質。利用生物信息學技術將蛋白質組和轉錄組進行關聯分析，并且進一步分析組織特異性高表達的基因和蛋白，以了解玉米組織結構和器官發(fā)生的調節(jié)機制，為研究玉米發(fā)育生物學研究提供了新的線索。相關成果2017年發(fā)表在Journal of Proteome Research上。

          

圖 2 實驗流程圖                          

文獻來源： Jia HT, Sun W, Li MF, et al. An integrated analysis of protein abundance, transcript level and tissue diversity to reveal developmental regulation of maize [J]. J. Proteome Res, December 18, 2017.
 

2.蛋白質組學在食品科學中的應用

        在食品安全研究中，蛋白組學的出現為食品科學的研究指明了方向，同時也為食品科學的研究奠定了良好的發(fā)展平臺。蛋白質組學在糧油食品、肉類食品、水產食品、乳品食品等方面的應用，不僅可以提高食品安全，并且在改善食品制作以及儲存條件的同時，還可以提高食品的口感以及營養(yǎng)程度。

        在熱處理過程中，肉類的主要成分蛋白質會發(fā)生結構性變形，如氧化、降解、變性和聚集。蛋白質的這些變化對最終肉制品的質量、顏色、嫩度和風味有重要影響，并最終影響適口性和可接受性。Tian等人利用2-DE等技術手段研究了在加熱中心溫度為72℃時用不同的烹飪方法，例如水浴烹飪-WB、短時歐姆烹飪-STOH和長時間歐姆烹飪-LTOH，對牛肉的顏色、烹飪損失、剪切值和蛋白質組變化的影響。蛋白質組學分析表明，歐姆烹飪的烹飪損失、剪切值顯著低于水浴烹飪（P<0.05）。利用2-DE蛋白組學技術成功鑒定到STOH和WB烹飪樣品之間的17個差異蛋白質，并鑒定出LTOH和WB樣品之間的13個差異蛋白質。大多數差異蛋白是肌原纖維和肌漿蛋白，可能與肉質的變化相關。WB烹飪可改變蛋白質溶解度并降低2-DE圖像中的蛋白質斑點強度。應用歐姆烹飪會產生更高質量的牛肉產品，并減少烹飪時間。相關成果2016年發(fā)表在Innovative Food Science & Emerging Technologies上。

        

 圖3  實驗流程圖                   

文獻來源：Tian X, Wu W, Yu Q, et al. Quality and proteome changes of beef M.longissimus dorsi, cooked using a water bath and ohmic heating process[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2016, 34:259-266.
 

3.蛋白質組學在畜牧獸醫(yī)領域的應用

        蛋白質組學在畜牧獸醫(yī)學研究領域應用主要集中在病原致病或耐藥機制靶蛋白的篩選、疫苗候選抗原及藥物靶標蛋白的篩選、動物遺傳育種、品系鑒定、品質改良等方面。

Wang等人基于iTRAQ的LC-MS / MS技術，比較了剛地弓形蟲的速殖子（T）、緩殖子孢囊（C）和孢子化卵囊（O）三個不同發(fā)育階段的蛋白質豐度。共鑒定到6285種蛋白質，其中在孢子化卵囊與速殖子，速殖子與緩殖子孢囊以及緩殖子孢囊與孢子化卵囊中分別鑒定到875、656和538個差異蛋白。對差異蛋白進行進一步的GO、KEGG和String分析，發(fā)現一些毒力相關因子和核糖體蛋白在整個生命周期的不同階段表現出不同的表達模式。這些發(fā)現對于了解弓形蟲的發(fā)育生物學具有重要意義，有助于發(fā)現新的治療靶點以更好地控制弓形蟲病。相關成果于2017年發(fā)表在Frontiers in microbiology上。

       

圖4 實驗流程圖                    

文獻來源：Wang Z X, Zhou C X, Elsheikha H M, et al. Proteomic Differences between Developmental Stages of Toxoplasma gondii Revealed by iTRAQ-Based Quantitative Proteomics[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8:985.

        Qin等人以豬為模型，利用iTRAQ技術研究豬膳食中蛋白質含量的限制（PL）對小腸黏膜蛋白質組學的改變。共鑒定并定量到5275種蛋白質，篩選出了202個差異蛋白。利用生物信息學技術對差異蛋白進行進一步分析并利用WB進行驗證，發(fā)現PL可以增強空腸黏膜對外來抗原的免疫應答，另外PL可以通過抑制mTOR途徑減少氨基酸轉運和細胞增殖。研究揭示了PL如何影響腸道生理功能，特別是氨基酸的運輸，腸粘膜結構和微環(huán)境以及腸道免疫。其中，mTOR信號通路可能在通過感知氨基酸的供給中，在調節(jié)腸道生理功能方面起著核心作用。相關成果2016年發(fā)表在Scientific Reports上。

             

圖 5 實驗流程圖                                 

 

文獻來源：Qin C, Qiu K, Sun W, et al. A proteomic adaptation of small intestinal mucosa in response to dietary protein limitation[J]. Scientific Reports, 2016, 6:36888.
 

二、蛋白質組學在疾病機理機制研究中的應用

        利用非標記定量蛋白質組學技術如：Label-free、SWATH及標記定量蛋白質組學技術iTRAQ、SILAC等蛋白質方法技術手段，可實現對不同樣品中的大量蛋白進行大規(guī)模的相對定量研究，為實現疾病相關機制的研究提供思路和見解。其圖解流程如下：

圖6 蛋白質組學在疾病相關機制研究中的圖解流程

1. 鑒定疾病生物標志物

        生物標志物(biomarker)是一種能客觀測量并評價正常生物過程、病理過程或對藥物干預反應的指示物，也是生物體受到損害時的重要預警指標，涉及細胞分子結構和功能的變化，生化代謝過程的變化，生理活動的異常表現，個體、群體或整個生態(tài)系統的異常變化等。生物標志物的研究在新藥開發(fā)、醫(yī)學診斷、臨床研究方面具有重要的價值，有助于提出更有效的診療手段，尤其在腫瘤、心血管疾病、糖尿病、神經性失調等慢性疾病與復雜疾病的防控上具有重要的價值。

        肝細胞癌（HCC）是最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率位居全球第六，全球死亡率位居第三。高頻率的早期轉移意味著HCC在確診時通常處于晚期，降低了患者獲得及時治愈的可能。因此，通過諸如血清生物標志物的檢測來診斷早期HCC是非常重要的。2017年，一篇報道在Oncotarget上的文章，利用iTRAQ蛋白質組學技術手段篩選出乙肝（HBV，n=10）組、肝硬化（LC，n=10）組、肝細胞癌（HCC，n=10）組和健康對照（HC，n=10）組之間的差異表達蛋白，并且對潛在的肝細胞癌標志物進行K均值聚類分析，GO和串聯網絡分析。最終選取3個肝癌標志物（CD14、GELS和QSOX1）進行WB驗證。綜合分析后鎖定CD14分子進行ELISA實驗確證，發(fā)現其具有作為早期肝癌診斷標志物的潛能。

圖7 實驗流程圖

文獻來源：J Guo, R Jing, et al. Identification of CD14 as a potential biomarker of hepatocellular carcinoma using iTRAQ quantitative proteomics. Oncotarget, 2017, 28;8(37): 62011-62028.

        由動脈粥樣硬化引起的心血管疾?。–VD）是引起全球人類死亡的主要原因。目前用于冠心?。–AD）診斷和監(jiān)測的成像方式和血清學指標主要集中在晚期癥狀階段，常發(fā)生在不可逆性心肌損傷后，限制了疾病的及時治療。為解決早期診斷CAD并及時給與干預和預防的問題，Cheow等人利用iTRAQ技術手段對心絞痛組(NMI，n= 20)、急性心肌梗塞組（MI，n=15）和健康對照組（Ctrl，n=14）血漿蛋白進行鑒定和定量，獲得371個高置信度的蛋白（FDR <1％，p <0.05），其中包括53個初步篩選的生物標志物。接下來利用MRM技術對初步篩選的生物標志物進行驗證，最終篩選得到8個潛在冠心病新型候選生物標志物。相關成果2017發(fā)表在Journal of Proteome Research上。

圖8 實驗流程圖

 

文獻來源：Cheow E S H, Cheng W C, Yap T, et al. Myocardial injury is distinguished from stable angina by a set of candidate plasma biomarkers identified using iTRAQ/MRM-based approach[J]. Journal of Proteome Research, 2017.
 

2.蛋白質組學技術在癌癥研究中的應用

        癌癥是世界上最嚴重的公共健康問題之一。人們已經做了諸多努力來治療癌癥，包括化療、光動力療法和光熱療法等直接療法。然而，這些療法都面臨一個共同問題，那就是對癌細胞殺傷力有限，并且對正常細胞具有細胞毒性。這一矛盾阻礙了這些療法在癌癥治療中的有效使用。一氧化碳(CO)是一種內源性氣體分子，其對細胞凋亡有廣泛的影響。CO 的直接使用能對癌細胞產生細胞凋亡作用，同時減少對正常細胞的毒性。2017年一篇報道在Advanced Materials上的文章利用iTRAQ等技術分析了一種能夠將內源性CO2轉化為CO的新型光催化納米材料HisAgCCN，并對其良好的生物相容性和抗癌化療效果進行了闡述。HisAgCCN處理PC-3細胞（人前列腺癌細胞）前后的樣品，共鑒定到4052種蛋白質，其中有146個差異表達的蛋白。利用生物信息學技術對差異蛋白進行進一步的GO、KEGG和String分析，并對一些差異表達蛋白進行進一步的表達驗證和功能研究，證實了新型納米材料HisAgCCN可以增強線粒體的生物合成，特異性地增強癌細胞的氧化應激反應。體內研究表明HisAgCCN / DOX聯合治療具有協同抑瘤作用，可為臨床癌癥治療提供新的方向。

圖9 實驗流程圖

 

文獻來源：Zheng D W, Li B, Li C X, et al. Photocatalyzing CO2 to CO for Enhanced Cancer Therapy[J]. Advanced Materials, 2017, 29(44):1703822.

3.蛋白質組學技術在糖尿病研究中的應用

        已知糖尿?。―M）與不良心臟重塑有關，即使沒有冠狀動脈疾病，高血壓或其他潛在病因存在的情況下，臨床心臟功能障礙、臨床心力衰竭風險也會增加。Hung等人利用iTRAQ等技術分析研究了老年2型糖尿?。═2DM）小鼠模型組（實驗組）與健康對照組小鼠（對照組）的心肌細胞膜蛋白質組學差異。共鑒定到1304個蛋白，并定量了1260個蛋白。亞細胞定位分析注釋了735個膜或膜相關蛋白以及315個質膜蛋白，包括179個轉運蛋白，30個通道和64個受體。與對照相比，來自T2DM小鼠的心肌細胞中有417種蛋白呈現出差異表達，其中287個蛋白上調、130個蛋白下調。對差異蛋白進行進一步的GO和IPA分析，發(fā)現老年T2DM小鼠的心臟收縮功能障礙與能量障礙及細胞骨架紊亂有關。這些發(fā)現加深了對糖尿病心肌病的細胞機制理解，并為治療提供了新的途徑。相關研究2017年發(fā)表在Journal of Proteome Research上。

圖10 實驗流程圖

 

文獻來源：Hung C L, Pan S H, Han C L, et al. Membrane Proteomics of Impaired Energetics and Cytoskeletal Disorganization in Elderly Diet-Induced Diabetic Mice[J]. Journal of Proteome Research, 2017, 16(10).
 

三、蛋白質組學在新藥研究中的應用

        新藥研發(fā)是一個周期長、高風險、高投入、高回報的產業(yè)，競爭的焦點在于篩選新藥，問題的核心是低成本、高效率地篩選新藥。蛋白質組學是從蛋白質整體水平上、從生命本質的層次上研究和發(fā)現生命活動的規(guī)律。由于疾病的發(fā)生與發(fā)展、藥物的作用大多是在蛋白質水平上進行的，因此，蛋白質組學研究克服了蛋白質表達和基因之間的非線性關系。將蛋白質組應用于新型藥物的研發(fā)，可通過對疾病與正常細胞中的蛋白質組進行比較，發(fā)現可成為藥物篩選作用靶標及與疾病相關的蛋白質。

        藥靶識別是理解藥物作用機制的關鍵步驟，可以改善藥物目前的治療體系并擴大藥物的治療潛力。Wang等人利用iTRAQ技術研究了一種能有效抑制腫瘤轉移的抗癌劑——穿心蓮內酯（andrographolide，簡稱Andro）在活癌細胞中的特異性細胞靶點。iTRAQ實驗共定量到291種蛋白質，其中有208個蛋白在統計學上可信度較高。經過進一步嚴格篩選，最終發(fā)現有75個蛋白質可作為Andro的特異靶點。隨后的pathway分析表明，Andro可能通過多種靶點和途徑發(fā)揮其抗癌作用，其中涉及癌細胞死亡途徑的靶標有30多個，涉及細胞遷移和轉移的靶標有15個，與炎癥相關的靶標有20個，與蛋白合成途徑相關的靶標有10個。作者發(fā)現NF-κB和β-actin是涉及癌細胞轉移途徑所有靶標蛋白中差異比例最高的兩種靶標蛋白質。因此，鑒于它們在腫瘤轉移中的關鍵作用，后期選擇這兩種蛋白質以進一步驗證Andro的抗癌細胞轉移作用。WB實驗、細胞遷移和侵襲實驗發(fā)現Andro具有新型抗轉移潛力。相關研究2014年發(fā)表在Molecular & Cellular Proteomics上。

圖11 實驗流程圖

 

文獻來源：Wang J, Tan X F, Nguyen V S, et al. A quantitative chemical proteomics approach to profile the specific cellular targets of andrographolide, a promising anticancer agent that suppresses tumor metastasis.[J]. Molecular & Cellular Proteomics Mcp, 2014, 13(3):876.

四、蛋白質組學在海洋環(huán)境中的應用

        蛋白質組學在海洋環(huán)境科學研究中有著廣泛的應用，特別是生態(tài)毒理、環(huán)境脅迫與應答、宏蛋白質組等研究方向。

        生態(tài)毒理蛋白質組學是從整體的蛋白質水平上，探討生物在污染物下，細胞蛋白的變化，并闡明污染物的毒性作用及其機制。海洋環(huán)境中多環(huán)芳香烴（PAH）的污染對海洋生物和人類的生存產生了嚴重的危險。 Enerstvedt 等人應用Label-free定量蛋白質組學技術研究了大西洋鱈經PHA處理后，血漿蛋白質組變化情況。該項研究中，研究者共設計了10組實驗，包括不同的PAH種類及其不同劑量處理實驗。實驗結果顯示：在鑒定到的369種血漿蛋白質中，其中有12種蛋白是在PHA處理中特異存在，可作為候選標志物。從分析出的差異蛋白中發(fā)現，上調的11個蛋白主要是免疫球蛋白，這表明大西洋鱈經PHA處理后發(fā)生了免疫反應?？傊?，該研究結果為今后大西洋鱈血漿蛋白組的研究提供了基礎，新的血漿蛋白生物標志物的發(fā)現為環(huán)境監(jiān)測環(huán)芳烴提供了科學依據。相關成果2017年發(fā)表在Chemosphere上。

圖12 實驗流程圖

 

文獻來源：Enerstvedt K S, Sydnes M O, Pampanin D M. Study of the plasma proteome of Atlantic cod ( Gadus morhua ): Effect of exposure to two PAHs and their corresponding diols[J]. Chemosphere, 2017, 183:294-304.
 

五、蛋白質組學在植物脅迫機制中的應用

        鹽脅迫是對植物非常重要的一種非生物脅迫，對植物的整個生命進程產生影響，例如降低作物的產量，從而形成復雜的自適應機制來應對鹽害，這種機制主要體現在光合作用的調節(jié)、滲透調節(jié)、選擇性離子吸收或排斥。Zhang等人應用iTRAQ定量蛋白質組學技術研究了在鹽脅迫條件下兩種棉花幼苗的耐鹽機制。在該項研究中作者選用的兩種旱地棉花品種：鹽敏感基因型（N）和耐鹽基因型(Z)。以NaCl處理的種子生長發(fā)育后幼苗為樣本，先采用iTRAQ篩選特異性蛋白并在生物信息分析中將蛋白質組學與轉錄組學進行關聯分析，后從RNA 層面進行了驗證。作者通過iTRAQ定量蛋白質組學技術從棉花幼苗中共鑒定到2300多個蛋白。其中有100多個差異蛋白，包括58種不同的鹽反應蛋白。鹽處理后，RNA解旋酶3和原葉綠素還原酶受到明顯抑制，而磷酸鹽相關的差異蛋白磷酸乙醇胺N-甲基轉移酶1被誘導，所有這些蛋白在鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。另外通過關聯分析發(fā)現有16個差異表達蛋白與差異基因表達相一致，qRT-PCR驗證結果與組學結果一致。相關成果2017年發(fā)表在Frontiers in Plant Science上。

圖13  實驗流程圖

 

文獻來源：Gong W, Xu F, Sun J, et al. iTRAQ-Based Comparative Proteomic Analysis of Seedling Leaves of Two Upland Cotton Genotypes Differing in Salt Tolerance[J]. Frontiers in Plant Science, 2017, 8:2113.

        鉛污染是越來越嚴重的環(huán)境問題，持續(xù)威脅著作物產量。為了揭示作物對鉛毒適應性的分子機制，Zhu等人運用SWATH技術對鉛作用后的擬南芥進行了蛋白質組學檢測，實驗組為鉛作用擬南芥幼苗24h，對照組為水作用擬南芥幼苗24h。共鑒定和定量了1719個蛋白，鉛作用后有231個蛋白含量發(fā)生了變化，其中有151個蛋白表達量上調，80個蛋白表達量下調。功能分類表明大多數Pb響應蛋白參與不同的代謝過程，相反，導致谷胱甘肽、茉莉酸（JA）、硫代葡萄糖苷（GSL）和苯丙素生產的途徑被上調。實驗表明Pb處理的擬南芥幼苗內源JA產生迅速升高，而JA缺陷型突變體和JA不敏感型突變體表現出Pb對根的超敏反應，暗示JA在Pb響應過程中起重要作用。鉛處理后GSL水平顯著提高，而在JA突變體中未檢測到這種誘導，這表明Pb誘導的GSL積累是JA依賴性的。該研究第一次將SWATH-MS分析技術應用于擬南芥，強調了JA在Pb脅迫過程中潛在的介導作用。相關成果2016年發(fā)表在Journal of Proteome Research上。

圖14 實驗流程圖

文獻來源：Zhu F Y, Chan W L, Chen M X, et al. SWATH-MS Quantitative Proteomic Investigation Reveals a Role of Jasmonic Acid during Lead Response in Arabidopsis[J]. Journal of Proteome Research, 2016, 15(10):3528.
 

六、蛋白質組學在外泌體研究中的應用

        外泌體（Exosome）也稱為多囊泡體，是活細胞分泌來源于晚期核內體的納米級脂質包裹體結構，直徑30-150nm，密度1.13-1.21g/ml，內部包裹了蛋白質、mRNA和microRNA等物質。包括腫瘤細胞在內的幾乎所有類型的細胞，都可以產生并釋放外泌體。外泌體由細胞分泌釋放出來，在血液等體液內傳播，最后又可被其他細胞吞噬，是細胞間通訊的重要介質。外泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等，而不同組織來源的外泌體在內容物組成和功能方面存在差異，同時這種差異受到細胞外基質和微環(huán)境的動態(tài)調控。越來越多的證據表明，宿主細胞或腫瘤細胞分泌的外泌體參與了腫瘤發(fā)生、生長、侵襲和轉移。而基于質譜的蛋白質組學是研究外泌體不可或缺的一項技術。將蛋白質組學技術應用于外泌體研究，可以極大地輔助疾病的早期診斷、疾病的治療、療效評價和預后分析。

        在腫瘤發(fā)生過程中，外泌體已被證明可促進腫瘤血管生成和轉移，而其在鼻咽癌（NPC）中的生物學功能尚不清楚。Chan等人利用超速離心法分離來自鼻咽癌細胞系-C666-1和非腫瘤NP細胞系（NP69和NP460）細胞培養(yǎng)上清中的外泌體，通過WB、蔗糖密度梯度和電子顯微鏡驗證外泌體的分子譜和生物物理學特性，并且運用iTRAQ蛋白質組學技術對分離出的C666-1、NP69和NP460外泌體蛋白進行鑒定和定量。從外泌體中共鑒定到640種蛋白質，與對照組相比，C666-1外泌體中有51種蛋白上調、89種蛋白下調。與預期的結果一樣，包括ICAM-1和CD44v5在內的促血管生成蛋白上調表達，而血管抑制蛋白TSP-1在C666-1外泌體中下調表達。進一步運用共聚焦顯微鏡研究和WB實驗證實了受體HUVECs中ICAM-1和TSP-1表達的改變是由于外泌體的內化。這些數據表明了鑒定到的血管生成蛋白在外泌體誘導的血管生成過程中具有關鍵作用，可作為潛在的治療靶標。相關成果2016年發(fā)表在International Journal of Cancer上。

圖15  實驗流程圖

文獻來源：Chan Y K, Zhang H, Liu P, et al. Proteomic analysis of exosomes from nasopharyngeal carcinoma cell identifies intercellular transfer of angiogenic proteins.[J]. International Journal of Cancer, 2015, 137(8):1830-1841.