首頁集團概況技術專題

肽鍵的穩定性案例個人解讀

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2018-07-18 15:03:12

前兩天一個北京的朋友問到肽鍵的穩定性問題，他想知道在還原劑的條件下肽鍵是不是不穩定，因為他的蛋白在非還原電泳中是28kDa, 以及部分14kDa, 在還原性電泳中是14kDa的均一條帶。今天借朋友的圖來說一下肽鍵的穩定性。

（1）蛋白質的耐熱性能和一級結構關系不大，更多的都是在高溫下，高級結構破壞疏水面暴露以后，聚集沉淀。比如一個雞蛋，即使咱們做成了雞蛋花湯，如果用SDS-loading buffer 溶解以后，大部分蛋白的都還保持一級結構的完整性。

（2）但是（1）這個說法并不嚴格，我們知道煲湯的時候，只要時間到位了，湯就可以變的鮮美，這事實上是蛋白質多肽鏈的水解，釋放出氨基酸以及其它一些小分子的原因。也就是說蛋白質的肽鏈只要煮的足夠久，最終也會被打斷，溫度越高降解的越快（中國式油煎蛋就比西方的冷鍋扒蛋要味道好）。

（3）通常情況下肽鍵要比二硫鍵要穩定。下面這個圖顯示了，在沒有還原劑的情況下50度，80度，100度煮樣5分鐘，都可以造成部分二硫鍵的打開，溫度越高打開比例越多。可見，即使在100度的非還原loading buffer中，二硫鍵的打開速度還是挺慢的，肽鍵斷裂的速度也就更慢了，在下圖中，基本上五法看到肽鍵的水解組分。

（4）許多實驗室sds電泳樣品處理條件是：98-100度煮3-5分鐘，我們通過下圖可以知道，在這個條件下，蛋白的肽鏈還是穩定的。且大部分情況下，80度加熱和100度加熱并沒有多少條帶上的差異。但是為何有人的電泳就結果很漂亮，條帶很sharp, 有些人的電泳就很糊呢？

（5）下圖的最后一個lane說明在還原劑中，5分鐘煮樣可以完全打開二硫鍵，但是如果你的還原劑質量差，那么會出現還原劑和蛋白之間發生再次交聯，也就是已經寡聚的還原劑和蛋白質上的巰基再次交聯在一起，此時的交聯是非特異的，條帶就會變糊。這就是為何我反復和兄弟們說還原劑要用TCEP的原因。

（6）當然，電泳糊還有很多其它原因，比如你用的甘氨酸，tris體系里面的純度。有些實驗室喜歡重復回收使用甘氨酸running buffer, 其實完全沒有必要。通常用來電泳的甘氨酸質量已經不太好，室溫放置很容易變粘（具體原因我也不清楚），這樣的緩沖液結果不會好。太差的甘氨酸里面雜質太多，在電泳膠的上端壓縮膠中的時候就有問題，進入分離膠就會出現離子對不平衡，擴散的厲害。這個就不深入討論了。

（7）最后，祝大家好好煲湯，只有湯做的好，電泳才能做的好，因為原理大約雷同。一個好廚師，也一定可以成為一個好的蛋白純化大師。

上一條：應用定量蛋白質組學分析SEMA3B-AS1抑制人骨髓間充質干細胞成骨分化機制

下一條：蛋白質組學技術在各領域的解決方案

4480YY私人影院免费无码,九九热视频这里只有精品,亚洲无线乱码高清在线观看一区

肽鍵的穩定性案例個人解讀