題目：Proteomic Analyses of Human Regulatory T Cells Reveal Adaptations in Signaling Pathways that Protect Cellular Identity（人調節T細胞的蛋白質組學研究揭示其在保護細胞信號通路中的適應性）

期刊：Immunity

影響因子：19.734

主要技術：轉錄組、蛋白質組

 

研究背景

        Treg cells（調節性T細胞）因其轉錄因子FOXP3的表達和抑制免疫應答的能力構成了獨特的CD4+T細胞譜系。Treg 細胞可以保護免疫耐受，抑制免疫細胞造成的組織損傷，促進組織修復。Treg細胞也有不好的一面，它可以阻礙機體對癌細胞的免疫能力，有研究認為Treg這部分的功能缺失可能是造成人類自身免疫疾病和過敏發生的基礎。因此，需要有針對性的促進或抑制人類疾病中的Treg細胞功能。Treg細胞和Tconv細胞密切相關，作者希望能夠在分子水平上對二者進行詳細研究和區分。

 

研究內容及結果

1. Treg細胞蛋白表達特征

        作者從健康人供體的外周血單核細胞（PBMCs）分離CD4 + T細胞亞群。這些細胞亞群包含nTconv細胞（CD45RA + CD25-）、記憶（m）Tconv細胞（CD45RA-CD25-）、nTreg細胞（CD45RA+CD25hi）和eTreg細胞（CD45RA-CD25hi）（圖1A）。兩種Treg細胞亞群都表達FOXP3和Helios并且缺乏IL-7受體α鏈（CD127），而nTconv和mTconv細胞亞群則相反，它們缺乏FOXP3和Helios，但是能表達CD127。使用高分辨率質譜（MS），作者鑒定了平均35,744±3,757個肽段，5,955±344個蛋白gurup。在所有五個CD4+T細胞亞群中定量了4,358種不同的蛋白質。其中，422種蛋白質基于其非標記定量（LFQ）值在CD4+T細胞亞群中表現出差異表達（FDR <0.05）。 總數據集的主成分分析（PCA，圖1B）、Pearson相關分析（圖1C）、差異表達蛋白的層次聚類（圖1D）證實了生物重復的密切相關性。作者分離CD4+T細胞亞群的原則并不是基于細胞譜系，而是根據CD45RA的表達（圖1D）。富集分析顯示，幼稚Treg和Tconv細胞共享參與磷酸戊糖代謝、NADP代謝和染色質組織等過程中的過表達蛋白（圖1D），而eTreg和mTconv細胞共享參與蛋白質合成、細胞運輸、信號傳導和凋亡的過表達蛋白（圖1D）。基于分化階段蛋白質表達的相似性可部分反映淋巴組織（幼稚細胞）與非淋巴組織（效應細胞）的優先定位。從聚類結果可以發現具體的Treg細胞蛋白特征，如nTreg和eTreg細胞共享某些高表達蛋白（cluster1）和低表達蛋白（cluster9-10），而eTreg細胞則獨自表現出在cluster2中蛋白高表達以及在cluster6中蛋白低表達。

圖1  CD4+T細胞亞群蛋白組學結果

 

2. Treg細胞的mRNA表達特征

        Treg細胞的蛋白組學結果與已發表的相似的細胞亞群的轉錄組學結果關聯性較低。為了進行直接比較，作者對五個CD4+T細胞亞群進行了全基因組mRNA深度測序。也基于它們的轉錄組分析發現，nTreg和nTconv細胞聚集在一起并遠離三種效應和記憶表型CD4+T細胞群（圖2A）。在五個CD4 + T細胞亞群（圖2B）之間總共649個差異表達mRNA（p <0.05），包括預期的標志基因如IL-7R、IKZF2（HELIOS）和效應細胞因子。作者分析發現，eTreg細胞的mRNA表達特征既有特異性（圖2B，cluster7;），也有和其他Treg細胞的一致的共性，如都可以表達FOXP3、IL2RA、TIGIT等分子（圖2B和2C，cluster6）。已經發表的文章結果也證明了作者的發現。作者發現，Treg細胞蛋白質組學結果和轉錄組結果中只有三個分子（FOXP3，SHMT2和SWAP70）表達量趨勢上發生重疊（圖2F）。事實上，553 個mRNA和409個蛋白質在五個CD4+ T細胞亞群之間顯著差異表達，并且可以在兩個水平上定量，但是二者僅重疊48個（圖2G）。因此，與眾多報道的文獻結果一致，相對于轉錄組結果，蛋白質組學會獲得明顯不同的結果（穩定狀態下分析的細胞中）。

圖2  CD4+ T細胞亞群mRNA表達結果

 

3. 蛋白質水平與mRNa水平的區別

        為了定量比較蛋白質和mRNA水平，作者使用基于強度的絕對定量分析蛋白質數據（iBAQ）。發現蛋白質和mRNA的豐度水平都超過五個數量級（圖3A和3D）。在蛋白水平中，豐度最高的是核糖體和代謝蛋白（圖3B），在mRNA水平中，豐度最高的是編碼參與（免疫）細胞、信號傳導和功能的核糖體組分和分子（圖3E），差異蛋白的豐度通常要比mRNA要高。

        作者對4792個mRNA-protein對的表達量在轉錄組和蛋白組水平上進行定位，發現其相關系數約為0.44±0.01。422種差異表達的蛋白質中，在mRNA水平檢測到409種，并進行定量比較（圖3G）。雖然蛋白質和mRNA表達水平通常相關（例如，FOXP3I、KZF2），但是大多數僅有一種（蛋白或mRNA）的表達量達到差異統計標準，這就解釋了差異表達的蛋白質和mRNA之間的有限重疊（圖2F）。作者發現一些分子僅在mRNA或蛋白質水平上真正差異表達（圖3H），這說明細胞調節具有一定的層次范圍。例如，對于FTH1（圖3G），是一個已知在嚴格的翻譯控制下的蛋白質（Hentze等人，2010），它在nTreg和eTreg細胞中豐度都很高；STAM2在mTconv細胞中雖然mRNA水平低，但是蛋白豐度很高（圖3G）, 另一方面，在nTreg和eTreg細胞中，mRNA上高表達但蛋白質水平并不高（圖3G）。

        作者認為聯合蛋白質組和轉錄組分析可以增加對通路分析的可信度。這樣的組合數據有力地論證了與其他CD4+ T細胞亞群相比，核因子kB（NF-kB）和JAK-STAT途徑在eTreg細胞中更容易脫敏（圖3I）。總之，其研究結果強調了蛋白質組學分析對細胞類型功能表征的重要性。

圖3  mRNA和蛋白表達的通路富集分析結果

 

4. Treg細胞具有穩定的蛋白質特征

        作者定義的常見Treg細胞特征由22個具有較高表達的蛋白質和29個低表達蛋白質組成（圖4A）。 免疫印跡和流式細胞術證實了這些蛋白質中的8種蛋白質組學數據。 在早期的Treg細胞蛋白質組學研究中，多是基于CD4+CD127-CD25+和CD4+CD127+ CD25-細胞，覆蓋的蛋白質組較少，所以并沒有找到類似作者發現的組學特征。常見的Treg細胞特征包括FOXP3、IKZF2（Helios）、代謝蛋白GK、UGP2和SHMT2、鐵儲存蛋白鐵蛋白重鏈和輕鏈（FTH1，FLT），以及溶酶體蛋白ASAH1、GGH、GUSB、SGSH和PLBD2，與Tconv細胞相比，它們都在Treg中以高豐度表達（圖4A和4B）。 該特征還包括糖酵解酶HK1、ME2、脂肪酸氧化酶AP00和線粒體脂肪酸轉運蛋白（CPT1A），與Tconv細胞相比，均在Treg中以低豐度表達。作者發現許多信號分子在常見的Treg細胞特征中是差異表達的，如脫氫泛素酶OTULIN的高表達，TNFα誘導的NF-kB活化的抑制劑和TNFRSF1A接頭TRADD的低表達（圖4A和4B），以及mRNA水平的TNFRSF1B的高表達，表明Treg細胞在TNFR信號傳導中表現出適應性。脂質磷酸酶INPP5D（SHIP-1）的高表達抑制PI3K-AKT信號傳導，mTOR活化劑RPS6KA1和RPS6KA3的低表達，同樣也表明PI3K / AKT / mTOR途徑的適應性，Treg細胞中STAT4和NFATc2的低表達突出。
 

        為了確定上文鑒定的蛋白質表達模式的穩定性，作者在體外T細胞擴增后進行蛋白質組學分析。通過CD3、CD28和IL-2刺激將nTreg和nTconv細胞在體外擴增2周，孵育4天，并通過FOXP3、Helios、CTLA-4和CD25染色以及FOXP3基因TSDR甲基化驗證它們的身份。值得注意的是，即使在通過CD3和CD28途徑重新激活后，Treg細胞核心特征中大多數蛋白質特異性表達模式也基本上是保守的（圖4C，4D）。作者認為Treg細胞在某些代謝功能以及重要信號通路的組成中與Tconv細胞本質上不同。

圖4  常見的Treg細胞蛋白組學特征

 

5. eTreg細胞特有的蛋白組學特征

        除了常見的Treg細胞特征外，作者發現eTreg細胞與其他CD4+ T細胞亞群相比有獨特的蛋白質簇表達特征：具有相對高的（eTreghi）和低的（eTreglo）表達（圖5A）。eTreghi簇包括參與DNA復制（MCM2，-3，-4，-6，-7，FEN1）、有絲分裂（CORO1C，TUBA1B，TUBB，MYH9）（圖5A和5B）和細胞凋亡（FAS，CASP3）的蛋白質，這和已有研究一致，說明這些細胞正在發生分裂。在eTreghi簇中的41種蛋白質中，17種在體外Treg細胞擴增后仍顯示出上升趨勢，其中5種達到統計學顯著性。同樣，eTreglo簇中39種蛋白中的25種在體外擴增的Treg細胞中保持低表達。eTreglo簇包含多種調節細胞凋亡敏感性的GIMAP（圖5A和5B）。重要的是，eTreglo簇中幾乎40％的蛋白質在細胞信號傳導中具有功能，它們包括NF-kB途徑的多種成分（PRKCB、DPP4、NF-kB1、NF-kB2）、細胞因子受體途徑（IL-7R、INPP4B、STAM2、STAT3）和TCR途徑（TRAT1、VAV1、THEMIS）。即使在體外培養之后，Treg細胞中許多蛋白質的表達相對較低，表明這種對信號通路的明顯脫敏作用，并不僅僅是通過這些通路在體內激活信號的負面反饋調節。

        FOXP3可以與關鍵轉錄因子（如IL17A和IL4）發生物理相互作用并且具有可以淬滅它們反式激活Tconv細胞效應基因的能力。反之亦然，如YY1的因子可以抑制FOXP3介導的Treg細胞程序的控制。作者為了確定Treg細胞中FOXP3的相對濃度是否足以“壓倒”這樣的相互作用因子，使用蛋白質組學標尺方法確定了每個細胞的蛋白質拷貝數，發現FOXP3在eTreg細胞中的拷貝數超過其許多伴侶蛋白，其中差別最大的是轉錄因子，如NFATc1和STAT4（圖5 C）。然而，對于一些轉錄因子（YY1、RUNX1和NFATc2），FOXP3過量僅為2至3倍，這可以解釋為什么FOXP3的適度減少允許Treg細胞產生效應細胞因子。最后，作者發現mTconv細胞中FOXP3的表達水平可能不足以有效中和其伴侶轉錄因子（圖5C）。

圖5  eTreg細胞蛋白特征

 

6. eTreg細胞具有效應基因表達的遲鈍途徑

        作者發現與Tconv細胞相比，eTreg細胞的IPA分析顯示TCR、模式識別受體（PRR）、細胞因子受體和TNFRSF家族誘導的NF-κB途徑信號傳導具有適應性。此外，通過NF-kB1和NF的流式細胞術證實，eTreg細胞中NF-kB1（p50）、NF-kB2（p52）和RELA（p65）的mRNA水平較低。因此，在eTreg細胞中，NF-kB1的反cd3和反cd28誘發的核核易位被削弱了，但在nTreg細胞中卻沒有。NFATc1和NFATc2蛋白水平在nTreg細胞和eTreg細胞中都較低。此外，NFATc2在普通Treg細胞的蛋白中含量較低，在Treg細胞在體外（圖4A和4D）后保持低表達。最后，在eTreg細胞轉錄組（圖6A）中，帶有NFATc2綁定元素的基因含量降低（圖6A），這表明該因素在體內的這些細胞中不那么活躍。

        炎性細胞因子控制Treg細胞行為可能會對其穩定性造成影響，在傳遞細胞因子受體信號的STAT轉錄因子中，STAT3、STAT6，尤其是STAT4在eTreg細胞中表現出低表達。STAT4表達在mRNA和蛋白質水平均較低，STAT4的低蛋白質表達是常見Treg細胞蛋白特征的一部分。在eTreg細胞轉錄組中，帶有STAT4結合元素的基因也沒有得到充分的表達（圖6A），這支持了體內eTreg細胞中STAT4活性降低的觀點。通過響應IL-12和I型IFN磷酸化Y693，在人CD4 + T細胞中激活STAT4，后者在人CD4 + Tconv細胞中誘導最強的早期STAT4磷酸化。這些細胞因子一致地誘導Treg細胞中STAT4的磷酸化比從血液中新鮮分離的Tconv細胞中更少（圖6C），并且這種差異在體外擴增的細胞中甚至更為顯著（圖6E）。STAT4是IFNg基因表達的主要調節因子，因此，作者推斷STAT4的低表達可能使Treg細胞與炎性細胞因子誘導IFN-g隔離。與此假設一致，IFN-α并且IL-12不能在Treg細胞中誘導IFN-g產生（圖6F）。然而，當故意過表達STAT4時，這些細胞因子確實激發了IFN-g的產生Treg細胞（圖6G）。值得注意的是，尤其是當用IFN-α或IL-12刺激Treg細胞時，STAT4的過表達也誘導了IL-2的產生（圖6G）和FOXP3表達的顯著喪失（圖6H和6I）。這些發現表明STAT4的低表達有助于在炎性環境中保護Treg細胞。

        因為Treg細胞需要來自炎性細胞因子的輸入，所以雖然STAT4表達低，但是作者仍驗證了Treg細胞是否能夠對I型IFN起反應。結果發現，在Treg和Tconv細胞中均等地誘導STAT1磷酸化（圖6B和6D）。 此外，IFN-α容易在抗CD3和抗CD28活化的Treg細胞中誘導轉錄因子T-bet和趨化因子受體CXCR3的表達（圖6J，6K）。 總之，這些發現表明STAT4的選擇性低表達允許Treg細胞響應炎性細胞因子（例如歸巢至發炎組織），而不損害Treg細胞。

圖6  Treg細胞中選擇性缺乏STAT4激活

7. 在Fr.III細胞中可以區分不同的細胞群

        Fr.III細胞是CD4+CD25+并且表達FOXP3，可以產生炎性細胞因子并且在體外缺乏強大抑制能力的細胞。該群體中的許多細胞表達CD127表明它是含有類似Treg或Tconv細胞的細胞的混合群體。為了更好地表征這一群體，作者根據CD127是否表達將其分成兩個部分，然后進行每個級分的蛋白質組學分析，并與nTconv、mTconv、nTreg和eTreg細胞的蛋白質組一起進行分析。層次聚類分析和PCA顯示CD127+ 亞群與mTconv細胞密切相關（圖7A和7B），說明CD127用于區分Tconv和Treg細胞有用性。值得注意的是，CD127- 亞群與eTreg細胞幾乎無法區分。CD127- Fr.III和eTreg細胞之間的緊密蛋白質組關系表明前者可能是真正的Treg細胞群，然而，FOXP3中的TSDR在CD127- Fr.III細胞中比在eTreg細胞中更加甲基化（圖7C）。此外，CD127-Fr.III細胞含有大部分產生一種或多種效應細胞因子的細胞（圖7F），這與eTreg細胞不同，因為eTreg細胞大多缺乏這種能力。

        并非CD127- Fr.III群體中的所有細胞都產生效應細胞因子，也并非eTreg細胞群中的所有細胞都缺乏產生此類細胞因子的能力，這表明即使這些明確定義的細胞群體仍可能是異質的。因此，作者在蛋白質組數據集中搜索了可能有助于區分具有不同功能特性的細胞的標記物。之前已有研究報道，在Treg細胞上發現的兩種標記物與陽性（CD49d）或陰性（CCR4）標志物與群體產生效應細胞因子的相對能力相關（圖7D）。流式細胞術分析顯示這些標志物表現出互斥的表達模式（圖7E），eTreg細胞群中產生IL-2或IL-17的少數細胞在表達CD49d的細胞中最為突出，這和已有的報道結果一致。然而，僅CD49d-CCR4 +表型完全排除了完全產生效應細胞因子的eTreg細胞（圖7G）。在CD127-Fr.III群體中觀察到類似的趨勢，其中CD49d-CCR4 +群體中不存在產生IL-17和IFN-g的細胞。然而，該群體在產生IL-2的能力方面仍然不同于相應的CD49d-CCR4 + eTreg細胞亞群（圖7G）。FOXP3的相對蛋白水平與每個群體中產生細胞因子的細胞的比例成反比。因此，FOXP3表達逐漸從eTreg細胞（最高）降低至Fr.III CD127-和Fr.III CD127 +（最低，但仍然高于mTconv細胞）。此外，在每個群體中，CCR4+CD49d-細胞總是表達比CCR4-CD49d +細胞更高的FOXP3。最后，TSDR僅在eTreg細胞中完全去甲基化，并且主要在CD127-CCR4+CD49d-Fr.III細胞中甲基化，其僅產生IL-2，但不產生其他炎性細胞因子。

        因此，作者的蛋白質組學數據使其發現CCR4和CD49d區分具有不同能力的細胞，以在eTreg細胞和Fr.III群體內產生效應細胞因子。這些標記物與常用的Treg細胞標記物組合的組合可用于細胞純化和診斷目的。例如，它們有助于闡明腫瘤中FOXP3+ CD4+T細胞的存在與患者愈后之間的關聯，特別是對于癌癥如結腸癌等。

圖7  蛋白質組學揭示了Fr.iii和eTreg細胞之間的功能異質性

 

文章小結

        通過對人類調節和常規CD4+T（Tconv）細胞的各種群體進行蛋白質組學和轉錄組學，獲得調節性T（Treg）細胞特性的分子特征，鑒定并定義了所有Treg細胞的蛋白質表達特征，以及定義效應Treg細胞的獨特特征。發現了Treg細胞中的代謝特征，以及細胞因子、TCR和共刺激受體信號傳導途徑的特異性適應性：適應——選擇性STAT4缺陷——保護Treg細胞穩態模型，該途徑通過炎性細胞因子起作用，而這些信號仍然可以通過其他途徑誘發關鍵的轉錄因子和引導受體。此外，作者的研究揭示了識別具有不同功能特性的FOXP3+ CD4+T細胞的表面標志物。作者的研究結果表明，信號通路中的適應性保護Treg細胞，并為進一步研究Treg細胞生物學提供了資源。

 

 

解析文獻

Eloy Cuadrado, Maartje van den Biggelaar, et al. Proteomic Analyses of Human Regulatory T Cells Reveal Adaptations in Signaling Pathways that Protect Cellular Identity. Immunity, 2018. 
 

參考文獻

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