研究結(jié)果中，在樣品 ≥1 LAD（左前降支動(dòng)脈）和AA（腹主動(dòng)脈）中總共鑒定到1925個(gè)蛋白group（以下簡(jiǎn)稱蛋白質(zhì)）。其中974種蛋白質(zhì)參與廣泛的生物過(guò)程、分子功能、細(xì)胞成分和經(jīng)典通路，有43個(gè)是之前研究中沒(méi)發(fā)現(xiàn)的蛋白。作者發(fā)現(xiàn)，LAD獨(dú)有的944種蛋白質(zhì)表現(xiàn)出無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)通常見(jiàn)于復(fù)雜的自適應(yīng)分子或細(xì)胞成分的自適應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中。此外，這些蛋白質(zhì)包括幾個(gè)不同的、可復(fù)制的共表達(dá)模塊，這些模塊與特定的細(xì)胞功能和位置大致相關(guān)，例如與細(xì)胞呼吸有關(guān)的線粒體蛋白（紅色模塊），涉及染色質(zhì)組裝和組織的核蛋白（綠松石模塊）和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（褐色模塊）。類似的無(wú)標(biāo)度拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和功能模塊結(jié)構(gòu)在來(lái)自AA的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)中也得到了明顯體現(xiàn)。無(wú)標(biāo)度拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表明，動(dòng)脈蛋白質(zhì)組可能來(lái)自復(fù)雜的自適應(yīng)系統(tǒng)。檢測(cè)到的蛋白質(zhì)的數(shù)量和多樣性，以及它們表現(xiàn)出無(wú)標(biāo)度拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的事實(shí)，為作者的蛋白質(zhì)提取和測(cè)量方法提供了有效性的判斷，并表明在翻譯和蛋白代謝之后，基因轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中復(fù)雜適應(yīng)性系統(tǒng)的特征仍然存在。

圖1 對(duì)人LAD蛋白加權(quán)共同表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

 

2. 正常冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈蛋白酶的比較揭示了線粒體蛋白質(zhì)質(zhì)量的顯著差異

        作者發(fā)現(xiàn)在LAD中檢測(cè)到數(shù)百種特異性蛋白質(zhì)，對(duì)LAD中專門檢測(cè)到的蛋白質(zhì)進(jìn)行GO富集分析，表明線粒體蛋白顯著富集（P值范圍，1.7×10-6至1.8×10-28）。為了證實(shí)LAD和AA樣本之間線粒體蛋白質(zhì)明顯的差異豐度，作者對(duì)完全正常的樣本（每個(gè)解剖位置n = 30）進(jìn)行了更靈敏的DIA-MS（也稱SWATH）分析，重點(diǎn)關(guān)注參與脂肪酸代謝、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)和線粒體生物合成的114個(gè)定量的線粒體蛋白質(zhì)。考慮到細(xì)胞材料和蛋白提取產(chǎn)量可能存在的位點(diǎn)差異和樣本差異，作者對(duì)幾個(gè)平滑肌細(xì)胞特異性管家蛋白和尸檢病例的年齡以及性別調(diào)整定量結(jié)果。總體而言，線粒體蛋白在LAD中的豐度是AA的1.98倍（P <0.001），其中氧化磷酸化蛋白豐度增加2.25倍（P <0.001），無(wú)機(jī)焦磷酸酶豐度增加10倍（P <0.001）。溶性細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白的類似比較顯示，與LAD相比，AA樣品中可溶性ECM蛋白豐度僅有6％增加（P = 0.01），但是生腱蛋白，在AA中增加10倍（P <0.0001）。

        作者認(rèn)為L(zhǎng)AD和AA組織之間線粒體質(zhì)量和潛在有氧能力的基本差異，可能反映了這兩種動(dòng)脈組織類型的不同能量需求。兩種動(dòng)脈組織的蛋白質(zhì)組學(xué)特征的異質(zhì)性強(qiáng)調(diào)了在表征動(dòng)脈組織的蛋白質(zhì)組學(xué)和功能生物學(xué)時(shí)，對(duì)動(dòng)脈解剖學(xué)特異性的需要。 

圖2 正常LAD和AA樣本中線粒體蛋白質(zhì)的比較

3. LAD和AA中的動(dòng)脈粥樣硬化組織呈現(xiàn)與TNF-α活化一致的蛋白質(zhì)組學(xué)特征

        為了明確早期動(dòng)脈粥樣硬化的蛋白組學(xué)特征，采用兩種互補(bǔ)表型分型策略：第一種，根據(jù)NL（正常內(nèi)膜）、脂肪條紋、FP（纖維斑塊）表面積占比對(duì)樣本進(jìn)行分型；第二種，根據(jù)樣品蛋白數(shù)據(jù)的凸分析方法進(jìn)行分型。為了充分利用兩種表型策略，作者使用主成分分析和層次聚類分析獲得每種LAD樣品的病理蛋白質(zhì)組分類，發(fā)現(xiàn)在第一主成分方向上分離高度富含F(xiàn)P或NL組織的樣品。比較這些富含F(xiàn)P和NL的LAD樣品，鑒定了89個(gè)差異蛋白質(zhì)（FC≥（+/-）1.7, q≤0.05）。這些動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)蛋白的生物信息學(xué)功能分析揭示了與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）途徑激活一致的模式（P = 2.64×10-7），同時(shí)也抑制胰島素受體、過(guò)氧化物酶激活受體-α（PPAR-α）和過(guò)氧化物酶激活受體-γ（PPAR-γ）途徑（P = 4.22×10-10,2.42×10-13,8.56×10-16）。AA樣品中動(dòng)脈粥樣硬化蛋白的類似分析（FP：n = 9，NL：n = 18）也產(chǎn)生與LAD中TNF活化相一致的模式（P = 1.92×10-5）。然而，在AA樣品蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)中，沒(méi)有令人信服的證據(jù)表明抑制胰島素受體、PPAR-α或PPAR-γ途徑。在靈敏度分析中，對(duì)于FP與NL樣品中觀察到關(guān)于上游調(diào)節(jié)劑和調(diào)節(jié)途徑的定性相似結(jié)果（q≤0.01）。LAD和AA的動(dòng)脈粥樣硬化樣品中胰島素受體、PPAR-α或PPAR-γ途徑的明顯抑制表明，早期動(dòng)脈粥樣硬化中已存在代謝紊亂。

圖3 LAD蛋白數(shù)據(jù)凸分析結(jié)果

 

圖4 病理蛋白質(zhì)組學(xué)表型

 

4. 冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈蛋白質(zhì)組的差異網(wǎng)絡(luò)分析

        復(fù)雜自適應(yīng)系統(tǒng)的一個(gè)重要特征是網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湓诓煌瑮l件下的變化潛力。因此，作者使用差異依賴性網(wǎng)絡(luò)分析，篩選在重組LAD中NL和FP之間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重排中起關(guān)鍵作用的蛋白，并發(fā)現(xiàn)三羧酸蛋白顯著富集（P = 4.8×10-6）。 隨后對(duì)單個(gè)三羧酸蛋白質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)富含F(xiàn)P的樣品中三羧酸蛋白質(zhì)與NL相比平均減少60％。對(duì)LAD的線粒體蛋白進(jìn)行DIA-MS分析，結(jié)果表明，在調(diào)整血管平滑肌特異性管家蛋白、年齡和性別后，與NL樣本相比，F(xiàn)P樣本中的多種線粒體蛋白質(zhì)一致減少。相比之下，對(duì)AA樣本中相同蛋白質(zhì)的類似分析顯示，兩種樣本的可溶性ECM蛋白均有適度的增加動(dòng)脈粥樣硬化。

 
圖5  對(duì)LAD FP蛋白差異依賴性網(wǎng)絡(luò)分析
 

圖6 LAD 和AA 的FP和NL樣品線粒體比較分析

 

5. 血漿多重動(dòng)脈粥樣硬化生物標(biāo)志物組的臨床驗(yàn)證

        為了確定通過(guò)使用人動(dòng)脈樣本發(fā)現(xiàn)的FP蛋白可以作為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的信息性血漿生物標(biāo)志物，作者開(kāi)發(fā)了一種高度可重復(fù)的MRM分析，對(duì)25種可以在血漿中測(cè)量的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。隨后，作者比較了45例經(jīng)血管造影證實(shí)的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的婦女（病例）和41例無(wú)體征、無(wú)癥狀、無(wú)冠心病危險(xiǎn)因素（對(duì)照）的相似年齡婦女的空腹蛋白水平。共發(fā)現(xiàn)13種有助于共同預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病情，同時(shí)也避免了過(guò)度擬合的蛋白。其中玻連蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β誘導(dǎo)蛋白、補(bǔ)體因子7和載脂蛋白B均為陽(yáng)性，與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化呈正相關(guān)，而三肽基肽酶1，ITI重鏈H1和白三烯A-4水解酶與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化呈負(fù)相關(guān)。

圖7 FP蛋白臨床驗(yàn)證

文章小結(jié)

人類動(dòng)脈蛋白質(zhì)組可以被看作是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，其結(jié)構(gòu)特征因解剖位置的功能和動(dòng)脈粥樣硬化的存在與否而有很大的不同。這些數(shù)據(jù)表明，早期動(dòng)脈粥樣硬化的線粒體蛋白豐度有顯著降低，同時(shí)也確定了血漿蛋白的一個(gè)子集，這些蛋白質(zhì)對(duì)血管造影診斷冠狀動(dòng)脈疾病具有高度的預(yù)測(cè)性。
 

解析文獻(xiàn)

Herrington DM , Mao C, et al. Proteomic Architecture of Human Coronary and Aortic Atherosclerosis. Circulation, 2018, 137(25):2741-2756.
 

參考文獻(xiàn)

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