western-blot(WB)實驗經驗總結
信息來源:金開瑞 作者:genecreate 發布時間:2018-11-13 13:29:46
我做了很久的WB,最大的一個難點感覺在于樣品制備上!蛋白的降解有些時候是你想象不到的,可能出奇的糟糕,也可能完全沒事~~
如果單獨做WB的話,感覺以“快速徹底裂解,先變性后保存”的原則比較有效,盡量選擇足夠強的裂解液,甚至直接給loading buffer裂解,然后取出部分蛋白定量,其余加入loading buffer100度充分變性,再分裝保存。有些時候比蛋白酶抑制劑更有效。
另一個感覺就是樣品中目的蛋白的量,限于WB的檢測下限問題,一般目的蛋白量最好別低于1ng(雖然ECL法下限是0.1ng,即100pg),最好在10ng以上為好。這就要求在做WB之前必須充分考慮目的蛋白的可能豐度,最好充分的準備工作然后再設計細胞量或者組織量,千萬別把樣品搞稀了,否則就不好辦了。
還有一個就是顯影液的選擇。如果選擇了不合適的顯影液,就會造成背景高,靈敏度差,易淬滅,發光時間短等問題。建議選擇合適的顯影液。我用的是Enlight-plus這一款ECL發光液,超靈敏的,發光時間也挺長,最后出來的圖像很清晰。
最后,還是多看文獻,在做某個蛋白之前最好看看別人是如何做的,有什么特殊要求,內參如何選等等。
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