題目：Involvement of serum-derived exosomes of elderly patients with bone loss in failure of bone remodeling via alteration of exosomal bone-related proteins

外泌體蛋白質組學研究老年骨質疏松

期刊：Aging Cell

影響因子：7.627

主要技術：TMT

 

研究背景

        骨質疏松和骨質缺乏影響著人們的身體健康，尤其是老年人。骨再生機制出現問題是引起骨質疏松和骨質缺乏的主要原因。破骨細胞分化和成骨細胞形成是促進骨骼再生的關鍵，膜整聯蛋白、Wnts 和TGFβ等可調節破骨細胞分化和成骨細胞形成。

 

研究內容及結果

1. 血清外泌體（SDE）提取及蛋白質組學定量

        作者從骨質疏松癥患者、骨質缺乏癥患者和正常志愿者血清中提取外泌體，并使用TMT蛋白質組學技術進行定量分析（圖1）。為了確認外泌體組分并驗證所鑒定蛋白質的外泌體來源，作者利用WB檢測外泌體表面marker CD63和ALIX在超速離心后混合血清樣品上清液和沉淀中的表達水平（圖2A）。本次共鑒定到1371種蛋白質，其中和外泌體數據庫ExoCarta比對發現有1160個重疊（圖2B），GO功能注釋結果表明大多數鑒定的蛋白來源于細胞質，對受體活性、細胞粘附分子活性和GTP酶活性的分子功能發揮重要作用，并參與信號轉導、細胞通訊和蛋白質代謝，與外泌體具有一致的生物學功能（圖2C-E）。這表明從血清中純化外泌體是成功的。此外，本次共篩選出585個骨質疏松癥差異蛋白（131/127）,包括225個上調蛋白和360個下調蛋白；116個骨質缺乏癥差異蛋白（130/127），包括110個上調蛋白和6個下調蛋白。

圖1 實驗技術路線

 

圖2 SDE蛋白質組學定量結果

2. 骨質疏松癥和骨質缺乏癥中外泌體蛋白的不同表達趨勢和中樞調節因子

        為了揭示骨質疏松癥和骨質缺乏癥中外泌體蛋白質表達水平的差異，作者進行了層次聚類分析（圖3A，C），發現在Cluster 1中骨質疏松癥差異表達蛋白（DEPs）（131/127）的表達水平顯著低于骨質缺乏癥。富集分析顯示Cluster 1骨質疏松癥DEPs主要參與粘著斑、G蛋白信號傳導和鈣肌動蛋白細胞骨架途徑的調節。在Cluster2中，骨質疏松癥和骨質缺乏癥參與TGF-β信號傳導途徑的蛋白下調趨勢相似。此外，富集分析顯示骨質缺乏癥DEPs主要參與細胞質核糖體蛋白途徑、細胞分化和高度動態的代謝過程。這些發現表明，SDE根據其起源和骨骼健康狀況在骨重建過程中發揮多種功能。

為了揭示DEPs之間潛在的相互作用，作者又進行蛋白互作網絡分析，在骨質疏松癥的DEPs中（圖3B），下調蛋白質ITGβ1、ITGβ3和CD34處于互作中心。這些蛋白質可能調節超過六種DEP，其中大部分參與細胞骨架組織、細胞粘附和機械感覺中的整合素信號傳導。骨質缺乏癥中處于互作中心的是上調蛋白質APP、NCL和VCAN，參與細胞粘附、與破骨細胞形成的蛋白質相互作用。

圖3  DEPs層次聚類分析和蛋白互作網絡分析

 

3. SDEs對破骨細胞分化和骨吸收的影響

        作者使用人PBMC衍生的破骨細胞作為模型，用來自骨質疏松癥或骨質缺乏患者的SDE培養TRAP陽性多核破骨細胞，發現其數量、重排面積顯著高于用來自老年正常志愿者的SDE培養的破骨細胞。用來自年輕志愿者的SDE和老年正常志愿者的SDE處理的破骨細胞的數量和面積沒有顯著差異。此外，用來自骨質疏松癥或骨質缺乏患者的SDE培養的破骨細胞的骨吸收明顯強于用老年正常志愿者的SDE培養的破骨細胞的骨吸收（圖4）。這些結果表明來自骨質疏松癥和骨質缺乏患者的SDE在體外促進破骨細胞形成。

圖4 SDE調節破骨細胞分化和骨吸收

4. SDEs對成骨細胞骨形成的影響

        用骨質缺乏患者的SDE培養21天的人成骨細胞系hFOB1.19的堿性磷酸酶（ALP）水平高于用老年正常志愿者的SDE培養的細胞。而用來自骨質疏松癥患者的SDE培養的hFOB1.19細胞中的ALP水平顯著低于用來自老年正常志愿者的SDE培養的細胞中的ALP水平（圖5）。此外，用來自老年正常志愿者的SDE培養的hFOB1.19細胞的ALP水平高于用來自年輕正常志愿者的SDE培養的細胞的ALP水平。利用含有維生素C和β-甘油磷酸鹽的成骨培養基誘導MC3T3-E1細胞后15天，在來自骨質疏松癥患者的SDE存在下培養的組中首次觀察到礦化結節。這表明骨質缺乏患者和老年正常志愿者的SDE促進體外成骨細胞形成，而骨質疏松癥患者的SDE抑制成骨中的成骨細胞形成。

圖5 SDE通過成骨細胞調節骨形成

 

5. ELISA驗證蛋白質表達水平

        作者選擇72個血清樣本中整合素β1、β3進行ELISA驗證，結果和組學結果一致。此外，ELISA數據還表明，每組男性和女性患者的這些蛋白質水平沒有顯著差異，外泌體整合素β1、β3與骨密度成正相關。

圖6  通過ELISA驗證蛋白質表達水平以及外泌體蛋白質和BMD變化之間的相關性分析

 

文章小結

        骨質疏松癥患者SDE中的蛋白質變化不僅抑制整合素介導的成骨細胞的機械感覺和活化，還引發破骨細胞的分化和再吸收。相比之下，骨質缺乏患者SDE促進了破骨細胞的活化和新骨質的形成，這可能導致骨重建的代償性升高。這些研究成果將有助于闡明SDE的病理生理功能，并有助于老年骨質疏松癥診斷和治療的發展。
 

解析文獻

Y Xie , Y Gao, et al. Involvement of serum-derived exosomes of elderly patients with bone loss in failure of bone remodeling via alteration of exosomal bone-related proteins. Aging Cell, 2018 , 17 (3)

 

參考文獻

1. Foster, L. J., Zeemann, P. A., et al. Differential expression profiling of membrane proteins by quantitative proteomics in a human mesenchymal stem cell line undergoing osteoblast differentiation. Stem Cells (Dayton, Ohio), 2005, 23, 1367–1377. 

2. Choi, D. S., Yang, J. S., et al. The protein interaction network of extracellular vesicles derived from human colorectal cancer cells. Journal of Proteome Research, 2012, 11, 1144–1151. https://doi.org/10.1021/pr200842h

3. Hoshino, A., Costa-Silva, B., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature,2015, 527, 329–335. https://doi.org/10.1038/nature15756

4. Chen, Y., Xie, Y., et al. Protein content and functional characteristics of serum-purified exosomes from patients with colorectal cancer revealed by quantitative proteomics. International Journal of Cancer, 2017, 140, 900–913. https://doi. org/10.1002/ijc.30496