外泌體是什么？

        外泌體（Exosome），是一種能被大多數細胞分泌的微小膜泡，具有脂質雙層膜結構，直徑大約40-200 nm。外泌體存在于體液中，包括血液、唾液、尿液和母乳等，不同組織來源的外泌體在內容物組成和功能方面存在差異，這種差異受到細胞外基質和微環境的動態調控。越來越多的證據表明，宿主細胞或腫瘤細胞分泌的外泌體參與了腫瘤發生、生長、侵襲和轉移。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析。

 

外泌體都有哪些分離提取方法？

        對于外泌體研究，分離和收集外泌體是非常關鍵的一步。目前對于外泌體收集有：超高速離心、密度梯度離心、磁珠免疫、超濾法、聚合物沉淀等幾種主要方法，各種方法均存在不同優缺點。

表1 各種分離方法優缺點比較

外泌體分離方法	操作	耗時	產量	純度	完整性
超速離心法	簡便	長	低	高	較差
密度梯度離心法	復雜	長	低	高	好
磁珠免疫分離法	簡便	短	低	低	好
超濾法	簡便	短	低	低	好
PEG沉淀法	簡便	短	高	低	好

但是嘞，大牛們的 CNS文章大多用的都是超速離心的方法，不信你看：

                   
                                                                                                                             
怎么知道提取的外泌體合不合格？

        鑒定外泌體提取合格與否有三大法寶：電鏡、NTA粒徑、Western blot檢測

        目前外泌體的分離提取還沒有到達爐火純青的地步，幾乎沒有任何一個單一實驗可以確定外泌體的存在。所以提取的外泌體需要通過三大法寶來相互佐證：形態學鑒定（電子顯微鏡技術）、NTA粒徑分析以及Western blot檢測標志蛋白（常用的有CD9、CD63、CD81、TSG101、HSP70等）。電鏡可以觀察樣品中是否有與外泌體相似的經典結構，有經典結構說明樣品中有外泌體或者與外泌體類似的，如溶酶體、蛋白聚團、支原體等結構。WB檢測發現樣品中具有外泌體的標志物，可以一定程度上排除溶酶體、蛋白聚團、支原體等情況，但依舊不知道樣品的整體情況。因為電鏡和WB的連用只能證明樣品中有外泌體，但是有多少、純度等就不得而知了。所以這個時候需要再來一個NTA實驗，NTA粒徑分析可以反應外泌體樣品中粒子的群體特征，以達到跟電鏡和WB相輔相成的作用。

圖1  Characterization of C666‐1, NP69 and NP460 exosomes. 

（引自Chan, Yuk‐Kit, Zhang H, Liu P, et al. Proteomic analysis of exosomes from nasopharyngeal carcinoma cell identifies intercellular transfer of angiogenic proteins[J]. International Journal of Cancer, 2015, 137(8):1830-1841.）

 

外泌體蛋白質組學研究，有啥好期待的嘞：

        外泌體可通過傳遞信息影響靶細胞的功能，激活細胞信號通路，在免疫、凝血、腫瘤等生理病理過程中發揮作用。而其中蛋白質的差異表達是區分不同來源外泌體的重要特點，是研究外泌體起源的重要途徑。蛋白質組學已經逐漸成為研究各種亞細胞組分蛋白質組的重要工具。針對外泌體進行蛋白質組學研究，可以揭示疾病發病機制、尋找疾病診斷和預后的生物標志物、篩選疾病治療靶點等。

        廢話少說，我們來看看人家具體是怎么運用的吧：

研究目的

        鼻咽癌（NPC）是鼻咽上皮常見的惡性腫瘤，在東南亞地區高發，在我國的廣東，廣西兩省尤為普遍。NPC具有高轉移率，> 60％的鼻咽癌患者出現頸部淋巴結浸潤，5％?8％的患者出現遠端轉移。但是NPC轉移的機制仍有待闡明。本研究的目的是為了闡明NPC來源的外泌體在腫瘤血管生成中的作用。

 

實驗流程

 
實驗小結

        作者利用超速離心法從NPC細胞系C666-1和非腫瘤性NP細胞系（NP69和NP460）培養基中分離外泌體并采用了不同的驗證方法來確保外泌體的質量。結果表明，在C666-1外泌體的誘導下，受體內皮細胞在體外顯著表達血管生成表型。結合iTRAQ定量蛋白質組學方法以及共聚焦顯微鏡和Western blot等分析，作者證實了外泌體將血管生成蛋白從NPC轉移到受體內皮細胞。表明NPC分泌的外泌體可以在體外誘導血管生成，血管生成蛋白在鼻咽癌細胞分泌的外泌體誘導腫瘤血管生成過程中具有關鍵作用，可作為潛在的治療靶標。

 

        外泌體在免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等生理病理上起著重要的作用。同時，不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。金開瑞可提供外泌體研究整體方案設計、外泌體提取/粒徑測量/電鏡檢測、外泌體蛋白組/轉錄組，助力您的外泌體相關研究。