題目：UBL3 modification influences protein sorting to small extracellular vesicles

期刊：Nature Communications

影響因子：12.353

主要技術：蛋白質組學、流式、外泌體

 

研究背景

        外泌體是一種小型胞外囊泡（sEVs），來自于多泡體（MVBs），通過運輸蛋白質、mRNA和miRNA介導細胞間的通信。然而，哪類蛋白質被歸為sEVs的分子機制還不是完全清楚。在這里，作者報道了泛素樣3（UBL3）膜錨定的Ub折疊蛋白MUB作為翻譯后修飾因子PTM調節蛋白向胞外囊泡轉化。作者發現UBL3的修飾對于將UBL3歸類到MVBs是不可缺少的。同時作者還發現從UBL3缺失型小鼠樣本中純化的sEVs總蛋白，與野生型小鼠相比減少60%，并從蛋白質組學分析結果中發現了1241個與UBL3互作蛋白，包括Ras。作者展示了UBL3改變Ras基因和致癌基因RasG12V突變體，UBL3的表達促進RasG12V到sEVs的轉變。綜上所述，結果表明PTM被UBL3取代并影響蛋白到sEVs的歸類轉化。

 

研究內容及結果

1. UBL3作為轉錄后調控因子的分析

        目前對于UBL3作為PTM轉錄后調節因子的作用還不清楚，為了明確這一調控機制，作者在MDA-MB-231乳腺癌細胞中過表達帶Flag的Flag-UBL3（16kDa），并通過免疫共沉淀純化UBL3蛋白。有趣的是，在過表達Flag-UBL3細胞中，UBL3條帶出現彌散現象，并在樣品裝入SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳之前添加2-mercaptoethano（βME+）后信號消失。為了驗證UBL3修飾確實發生在體內，作者建立了UBL3敲除小鼠，并在腦組織（此組織UBL3高表達）中分析PTM，發現PTM表達下降。作者同時構建了UBL3C113/114突變，檢測發現不僅在MDA-MB-231細胞中，在每一個所檢測的細胞中UBL3均不表達。但在UBL3C113A和UBL3C114A突變體中，UBL3修飾表達雖降低但仍能檢測到其表達。

  

 

圖1 UBL3作為轉錄后修飾因子的分析

 

2. UBL3向MVBs和sEVs轉化過程中UBL3的修飾不可缺少

        作者通過免疫熒光檢測UBL3的亞細胞定位，發現細胞質中UBL3修飾程度下降。接著構建UBL3加EGFP熒光，并與MVBs的標記物CD63進行融合分析，進一步驗證UBL3在MVBs多泡體中富集。為進一步證明MVBs多泡體中UBL3修飾與定位，作者檢測了UBL3C113A、UBL3C114A、UBL3C113/114A及UBL3△1與CD63融合分析，與野生型UBL3檢測不同，野生型的未見到與CD63融合。為了了解UBL3在多泡體及膜中的定位，作者又進一步安排了免疫電鏡檢測。將加了Flag標簽的UBL3質粒轉染進MDA-MB-231細胞后，UBL3在MVBs及質膜中表達清晰，在線粒體及核膜中未檢測到表達。其中UBL3△1主要定位于質膜，不在MVBs中。這些結果顯示UBL3修飾在MVBs形成中是必須的。

    

圖2 UBL3向MVBs轉化依賴UBL3修飾共定位檢測
 

 

圖3 亞細胞定位及UBLs到外泌體的歸類

 

3. UBL3敲除小鼠中外泌體中總蛋白下降，UBL3修飾影響蛋白向胞外分泌

        作者在前期的研究中發現，MVBs更多的傾向于分泌成胞外囊泡EVs，將MDA-MB-231細胞分泌上清分別在2000×g（2K）離心力、10000×g（10K）離心力及100000×g（100K）離心力下離心，發現在100k離心力下UBL3富集程度最高。通過對構建的UBL3敲除小鼠與正常小鼠進行蛋白質組學定量分析，發現UBL3敲除小鼠中外泌體總蛋白含量比野生型降低60%。

圖4 UBL3敲除小鼠中外泌體總蛋白量鑒定

 

        為更好的了解UBL3修飾后其生理功能，作者進行了全面的蛋白質組學研究分析，UBL3互作蛋白依賴于兩個C端半胱氨酸殘基的方式。同時作者發現在與UBL3互作的蛋白中至少有22個與疾病相關的分子，包括與腫瘤形成、代謝、轉移等相關，例如HRAS、KRAS、TGFBR1、TGFBR2、RB1、ITGA6、ITGB4、mTOR、TSC2及APLP2。同時發現與免疫應答相關的分子mTOR、RPTOR及TSC2，Notch信號分子NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3等。為檢測UBL3是否經外泌體形式引起受體細胞中Ras信號激活，作者將從經RasG12V轉染的MDA-MB-231細胞上清中提取的經PKH67包被的外泌體與細胞共孵育，檢測磷酸化ERK的表達情況，結果發現，相比于從UBL3C113/114A及RasG12V共轉染后提取外泌體孵育組，磷酸化的ERK（pERK）在經野生型UBL3及RasG12V共轉染后外泌體孵育組pERK表達明顯上調。UBL3修飾誘導了RasG12V到外泌體sEVs轉化過程中Ras信號的激活，UBL3作為一個類似于標簽的作用向sEVs傳遞蛋白。

圖5 UBL3修飾影響蛋白到胞外分泌檢測

 

文章小結

1.通過研究數據表明UBL3通過C端半胱氨酸殘基二硫鍵結合靶蛋白，盡管UBL3有泛激素類似的區域，但UBL3修飾與傳統泛激素作用不同。

2. 作者證明了UBL3修飾在UBL3向MVBs及sEVs轉化過程中起重要作用。檢測到1241個與UBL3C端半胱氨酸殘基互作蛋白，其中29%被注釋為胞外泌體，同時發現UBL3敲除小鼠中外泌體蛋白總量降低60%，顯示UBL3極大可能參與過半的外泌體蛋白歸類過程。UBL3與特定蛋白的結合是短暫的，只有UBL3修飾后蛋白在細胞裂解過程中穩定存在。

3. 外泌體sEVs中的特異性蛋白在腫瘤的生長發生及轉移過程中其中重要的作用。本文中作者通過蛋白質組學確定了1241個依賴于兩個C端半胱氨酸殘基結合與UBL3互作的蛋白，其中包括了至少22個疾病相關分子，影響pERK磷酸化蛋白的表達。因此，抑制UBL3修飾可能成為與Sev相關疾病的治療靶點，具有潛在的影響。

 

解析文獻

Hiroshi Ageta, Natsumi Ageta-Ishihara et al. UBL3 modification influences protein sorting to small extracellular vesicles. Nature Communications, 2018, DOI: 10.1038/s41467-018-06197-y

 

參考文獻

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        外泌體在免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等生理病理上起著重要的作用。同時，外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。