病毒鑒定的方法有哪些？
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2018-12-13 11:42:55
從培養的細胞中分離病毒，然后采用免疫熒光和分子生物學技術進行病毒核酸檢測已被成功地用于病毒的鑒定。目前最常用的病毒定量檢測方法有以下三大類：用于病毒感染力檢測的技術，如病毒空斑形成試驗，半數組織培養感染劑量TCID50測定和免疫熒光等；病毒核酸和病毒蛋白檢測技術，如實時定量多聚酶鏈反應（qPCR），免疫印跡，免疫沉淀，酶聯免疫吸附測定（ELISA）和血凝試驗等；還有就是那些直接對病毒顆粒進行計數的方法，如流式細胞分析或透射電鏡技術。
病毒檢測方法的局限性
病毒鑒定方法
1. 培養細胞的顯微學觀察
材料和儀器
細胞生長培養基：含10% FBS(胎牛血清), 4-6 mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，鏈霉素，慶大霉素，兩性霉素等
維持培養基：上述新鮮的細胞培養基，但血清FBS濃度減少至為2%
宿主細胞：鋪滿單層細胞的8孔培養腔室玻片（chamber slides）
PBS磷酸緩沖液
Bouin's固定液
吉姆薩（Giemsa）緩沖液
吉姆薩（Giemsa）染色液
丙酮，丙酮：二甲苯（2:1），丙酮：二甲苯（1:2），二甲苯
中性樹膠
移液槍頭 (10 到100 微升)
移液管
生物安全柜（超凈臺）
二氧化碳培養箱
倒置顯微鏡
實驗方案
接種宿主細胞至Chamber Slides：選擇合適的細胞接種密度（比如8-孔Chamber Slides，接種30,000細胞/孔），培養基為細胞生長培養基（10%FBS-DMEM）。輕輕地前后左右搖晃chamber slides使細胞分布均勻。將細胞置培養箱培養過夜，第二天，顯微鏡下觀察細胞確認細胞是否分布均勻并達到80%以上的融合度。
制備不同稀釋度的病毒液：標記6支無菌離心管，第1管加入990 μl細胞生長培養基，剩下5管加入900μl細胞生長培養基。按以下方法進行梯度稀釋：在第1管中加入10 μl病毒原液（稀釋度1:100）充分混勻，然后從第1管吸100 μl至第2管中混勻，依次類推，進行10倍梯度稀釋。管1至管6的稀釋度分別為 10-3 到 10-7。
感染細胞：吸去培養孔中的培養液，每孔加入0.5 mL維持培養液（2%FBS-DMEM），再加入100 μl不同稀釋度（10-2 至 10-7稀釋）的病毒液至其中一孔，留一孔不加作為空白對照。將細胞置二氧化碳培養箱37oC 或 34oC 培養1-4周，追蹤觀察致細胞病變效應（CPE）發生情況。
吉姆薩染色：一旦觀察到細胞病變效應，輕輕地用PBS將細胞洗3次，每次5min，然后加入Bouin's固定液固定10 min。用吉姆薩緩沖液洗3次，然和加入Giemsa染液染色1 h，再用吉姆薩緩沖液清洗后依次用丙酮處理15s，2:1的丙酮-二甲苯處理30s，1:2的丙酮-二甲苯處理30s，最后用二甲苯處理10 min緊接著用中性樹膠封片。顯微鏡下觀察CPE，包涵體，細胞融合及病毒空泡形成情況。病毒感染細胞后形成的CPE圖片范例可以在很多圖譜，網站和博客上找到，例如ASM Microbe Library
2.免疫熒光(IF)檢測方法
材料和儀器
細胞生長培養基：含10%FBS(胎牛血清), 4-6mM Glutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，鏈霉素，慶大霉素，兩性霉素等
宿主細胞：鋪滿單層細胞的8孔培養腔室玻片（chamber slides）
PBS磷酸緩沖液
一抗
FITC標記的二抗
細胞核染料DAPI
5-4 %多聚甲醛（PFA，pH7.4），或者甲醇
移液槍頭 (10 到100 微升)
離心管
生物安全柜（超凈臺）
二氧化碳培養箱
熒光顯微鏡
實驗方案
接種宿主細胞至Chamber Slides：選擇合適的細胞接種密度（比如8-孔Chamber Slides，接種30,000細胞/孔），培養基為細胞生長培養基（10%FBS-DMEM）。輕輕地前后左右搖晃chamber slides使細胞分布均勻。將細胞置培養箱培養過夜，第二天，顯微鏡下觀察細胞確認細胞是否分布均勻并達到80%以上的融合度。
病毒感染：每孔細胞加0.1 mL病毒儲存液，留一孔不加作為陰性對照。將細胞放回CO2 培養箱，37°C 或 34°C 培養48h。
免疫熒光染色觀察：病毒感染48h后，吸去培養液，將細胞用預冷的甲醇固定5min（也可用新鮮制備的4%多聚甲醛固定）后，用含0.2% triton X的PBS室溫破膜5min。將細胞用PBS清洗后，加入推薦濃度的一抗孵育2h，PBS清洗5遍，然后再加入熒光（Alexa fluor 488 或FITC）標記的二抗進行孵育，PBS清洗5遍，加入DAPI染細胞核，在相差及熒光顯微鏡下觀察結果。
3.分子學方法
用實時定量逆轉錄PCR（Real-time RT-PCR）來檢測流感病毒比終點檢測方法更為快捷，且敏感度跟細胞培養法相當甚至更佳
用分子技術從臨床樣本中直接對病毒基因組進行鑒定是21世紀的重大發現之一。核酸擴增技術包括PCR、基于核酸序列的擴增(NASBA)和勞倫斯利弗莫爾微生物檢測陣列(LMDA)等都無疑是快速檢測和鑒定大多數已知人類病毒的領先技術。PCR可以在 體外 將DNA序列的一段特定區域擴增 106倍，因此是一種極其敏感的檢測手段。PCR還可以用于病毒RNA的鑒定，只需先將RNA逆轉錄成DNA，然后再進行PCR分析，這一方法被稱之為逆轉錄PCR（RT-PCR）。
采用特異性的引物鑒定甲型流感病毒。M：Marker，陽性對照（+），陰性對照（-），泳道1-10為擴增的212 bp甲型流感病毒片段
用實時定量逆轉錄PCR（Real-time RT-PCR）來檢測流感病毒比終點檢測方法更為快捷，且敏感度跟細胞培養法相當甚至更佳
Real-time PCR實驗原理圖
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