題目：Photo-Powered Artificial Organelles for ATP Generation and Life-Sustainment

光動力人工細胞器促進ATP合成并能夠維持個體生命

期刊：Advanced Materials

影響因子：21.950

合作技術：Label-free

 

研究背景

        作為生命形式的細胞內能量轉移 “貨幣分子單位”——三磷酸腺苷（ATP）幾乎是所有生命形式中驅動細胞內生化反應最重要的直接能量來源。ATP生成過程中功能障礙會導致嚴重疾病，如身體衰老、線粒體疾病等。然而，迄今為止，生命中可控制的ATP生成仍然是一個未實現的目標。有效的替代能源供應系統能減少線粒體中的代謝應激，并有助于抗衰老和壽命延長。

 

研究結果

        受植物光合作用啟發，作者提出并構建了一種高效生命支持細胞內光學驅動系統（HELIOS）。在該系統中，將菠菜類囊體片段與磷酸膽堿和膽甾醇重新組合，合成一種蛋白質脂質體納米顆粒結構。該系統能夠產生胞質電子，在光照下可以顯著提高細胞內ATP水平。為了研究HELIOS聯合光照射是否能提高ATP水平和生物活性，作者選擇了小鼠心臟和斑馬魚分別作為體內模型和體外模型進行實驗研究（圖1a）。

        通過透射電鏡（TEM）、動態光散射（圖1b）和掃描電鏡，作者測定合成的HELIOS納米顆粒的平均粒徑為75nm。根據TEM EDX圖譜結果（圖1c），Mg均勻分布于顆粒之間，證明光合蛋白和脂質體成功結合。隨后，作者通過Label-Free定量蛋白質組技術，在HELIOS COS7細胞中共鑒定到1206種蛋白質（圖1d-e，圖2，圖3），其中三分之二與葉綠體有關（圖1e）。作者對23種光合蛋白進行深入分析，發現HELIOS顆粒中光合蛋白顯著富集（圖1f）。在模擬的細胞內環境中，觀察到光系統I的抑制劑(diquat dibromide, oxyfluorofen)和光系統II的抑制劑(fluorodifen, atrazine)可以抑制HELIOS ATP的生成（圖1g），類囊體解偶聯劑(nitrofen, perfluidone) 對HELIOS  ATP生成的影響較小。這些結果表明，HELIOS的工作機制與類囊體相似，但并不完全相同。

        那么HELIOS在光照射下是否能夠提高細胞內ATP濃度呢？經過一系列的優化實驗，作者發現0.235 mg L−1 HELIOS在紅光（18 W）照射30分鐘的條件下，可以將COS7細胞內ATP水平提高2.45倍。為了證明HELIOS的通用性，作者又使用了其它幾種哺乳動物細胞，包括上皮細胞（HLEC, COS7, HEK-293）、癌細胞（HeLa, B16, 4T1, CT26, EMT-6, MCF-7）、免疫細胞(RAW)、成纖維細胞（3T3）、心肌細胞（myocal cells），在與HELIOS孵育并照射紅光的每個細胞系中，ATP水平均有增強。相較于無光照對照組，光照射組ATP濃度提高1.38-2.45倍（圖1h），說明HELIOS可以促進ATP的合成并不是在某個細胞內的特定過程，而是在各種細胞中普遍適用的途徑。

圖1 HELIOS系統構建及表征

 

 

圖2  HELIOS系統蛋白質組學分析

 

圖3 HELIOS系統蛋白質LC-MS/MS分析

        體外環境中，HELIOS系統并不能將ADP轉化為ATP，因此，作者又驗證了是否有內源性線粒體參與了ATP生成的改良過程。作者利用細菌內外膜泡（ISO）刺激線粒體的電子傳遞鏈，發現直接混合ISO、HELIOS和ADP不會產生任何多余的ATP（圖4a）。進一步加入水溶性電子受體NAD+可以顯著提高ATP的生成能力。因此，作者認為HELIOS負責將光子傳遞給電子，然后將電子傳遞給ISO產生ATP。此外，化學合成的半導體碳氮化物在光輻照射下能夠產生光電子，也可以增強ISO的ATP生成。

        如圖4b所示，利用HELIOS產生的NADPH來增強線粒體ATP的合成，多余的NADPH需要通過轉氫酶轉化為NADH。作者發現在添加2,3-丁二酮（質子轉移轉糖激酶抑制劑）后可以顯著抑制HELIOS的效率，糖酵解抑制劑2-脫氧-d -葡萄糖（2-DG）的添加并不影響HELIOS產生ATP的能力。有趣的是，雖然NADH的氧化并不發生在TCA循環中，但發現TCA循環的抑制劑乙酸氟（FA）會切斷HELIOS細胞的能量供應。因此，作者推測TCA循環的一些中間產物可能參與了胞質選擇性向線粒體的轉運，利用TCA循環的中間產物作為載體進行電子遷移的生化系統MAS可能參與了這一過程。此外，作者認為HELIOS介導的ATP生成依賴于氧化磷酸化過程中NADH的消耗。添加氧化磷酸化抑制劑魚藤酮（ROT）后，ATP生成顯著下降。綜上所述，通過MAS，細胞質內光照射HELIOS產生的NADH可以轉移并用于線粒體的氧化磷酸化過程中，從而繞過糖酵解的TCA循環（圖4c），而AOA（aminooxyacetate）的加入可以完全逆轉HELIOS的作用。

        為了更好地了解HELIOS對細胞代謝的影響，作者采用GC-MS法對128種差異代謝物進行代謝組學分析，發現HELIOS +光處理后的細胞代謝出現全面上調（圖4d）。這說明ATP水平過高可能會改善細胞功能。此外，對代謝產物的層次聚類分析和主成分分析表明，HELIOS +光處理組細胞的代謝水平分別與磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）和HELIOS +暗處理組相比有很大的差異。作者發現HELIOS +光處理對代謝（(found: 515,total: 2045)）和小分子轉運(found: 92, total:430)的影響率分別為25.2%和21.4%（圖4e）。此外，HELIOS可以顯著增強丙酮酸代謝、TCA循環、碳水化合物代謝等ATP生成相關通路（圖2f）和與氨基酸代謝、核苷酸生物合成、維生素代謝相關的上調通路，這些結果表明，HELIOS不僅可以促進ATP的生成，而且可以全面影響細胞的代謝。

 

圖4 HELIOS在動物細胞中的作用機制

        接下來，作者又設計并進行了一系列的實驗來驗證HELIOS是否能夠增強細胞、器官甚至個體的生物功能。作者首先研究了HELIOS對蛋白質生物合成過程的影響。通過利用綠色熒光蛋白(GFP)轉染COS7細胞，研究HELIOS對哺乳動物細胞整體蛋白質生物合成的影響，發現經過HELIOS +光處理細胞的熒光強度顯著提高2.6倍。為了觀察HELIOS對細胞功能增強的影響，作者分離了原發性心肌細胞。心肌細胞自發搏動實際上是ATP消耗的敏感過程，因此，作者推測HELIOS可能能夠以自養的方式維持心肌細胞的生物學功能（圖5a）。在無糖培養基條件下培養心肌細胞12 h后，心肌細胞搏動頻率從77.6 min−1 下降到18.6 min−1，而光+HELIOS心機細胞搏動頻率維持在41.3 min−1（圖5b），搏動幅度則是對照組的2.1倍。葡萄糖復蘇后，光+HELIOS心機細胞搏動頻率也顯著高于對照組，這說明在經過光照處理的HELIOS心肌細胞中，ATP濃度明顯升高(圖5c)。

        隨后作者又將HELIOS系統作用到器官和個體模型上。通過建立大鼠缺血心臟模型，研究HELIOS能否在極端能量限制下對缺血心臟提供保護作用。發現HELIOS處理后大鼠缺血心臟可以顯著降低血清肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）的增加，同時降低了TnT的生成。此外，作者還觀察到心肌組織ATP水平升高，證實HELIOS具有心臟保護作用（圖5d-f）。隨后作者又構建了斑馬魚模型（圖6a），發現在實驗進行6d后，除少量的紅色熒光由于攝食原因在仔魚胃中積累外，大部分紅色熒光均勻分布在仔魚體內，包括眼睛和尾巴（圖6b）。和對照組相比，HELIOS +光處理斑馬魚的平均體長略長，死亡率也較低。行為學實驗發現，HELIOS +光處理的仔魚呈現強健的運動活性(圖6c)，而在其他三個對照組中，超過85%的斑馬魚表現出游泳活動減少。這一結果不僅表明光照射在HELIOS支持的ATP合成過程中發揮了關鍵作用，還表明能量來源可能不是來自HELIOS的消化或吸收，而是來自HELIOS支持的“光合作用”。觸覺反應實驗表明，和對照組相比，實驗組反應迅速，靈敏度高，平均移動距離長（圖6d-e）。對各組魚的ATP濃度分析發現，HELIOS +光照處理組的ATP和NADH生成量顯著增加（圖6f），這與游泳活動和觸覺反應試驗結果一致。為了排除環境因素可能的干擾，作者將HELIOS注射到斑馬魚體內，光照射后發現ATP水平增加1.4倍(圖6g)。同時也證明HELIOS產生ATP的效率在活體動物中可以維持8小時(圖6h)。HELIOS在體內應用過程中，氧化應激水平沒有明顯升高（圖6i）。所有這些結果都證明HELIOS可用于脊椎動物中增強ATP生成，并在體內具有良好的保留能力（圖6j）。

 

圖5  HELIOS對心臟器官的影響
 

 

圖6  HELIOS在斑馬魚體內的影響

研究結論

作者構建的HELIOS系統能夠驅動ATP合成和維持細胞生理活性。在不同細胞系中，紅光照射下加入HELIOS可以顯著提高細胞內ATP的生成，同時還可以全面促進細胞功能，如熒光蛋白的合成、細胞運動、胰島素分泌。在器官和個體層面，HELIOS可以從心肌梗塞中拯救小鼠心臟并維持禁食后的斑馬魚生命。光動力人工細胞器可以加深對新陳代謝的理解，并促進針對細胞內能量供應的光學療法的發展。

 

解析文獻

Di-Wei Zheng, Lu Xu, et al. Photo-Powered Artificial Organelles for ATP Generation and Life-Sustainment[J]. Advanced Materials, 2018, DOI: 10.1002/adma.201805038. 9.

 

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