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免疫沉淀（IP）常見問題解答

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2018-12-28 09:36:04

剛開始做免疫沉淀（IP）的時候肯定會出現各種狀況，遇到很多問題，下面我們整理了IP常出現的問題，并附上了解決方案。

首先，當然是做出來的背景很高，可能存在的原因有如下：

1．洗滌不夠充分

解決方案:在加入洗滌劑洗滌的時候，應當蓋上管蓋反復顛倒數次，動作應當輕柔，但次數要有保證，接著在放到離心機里離心。

2．去垢劑不溶性蛋白殘留

解決方案：加入上樣緩存液，煮5分鐘左右，而后離心，吸取上清進行WB

3．非特異性蛋白和珠子產生結合

解決方案：珠子應用BSA充分預封閉，確保BSA新鮮。具體方法為，新鮮瓊脂糖珠玉1%BSA（PBS溶解）孵育1h，使用前再用PBS洗滌3-4次。

4．抗體特異性不夠

解決方案：使用可以做IP的抗體，閱讀文獻購買適合做IP的抗體，根據文獻報道的加入抗體的量進行IP。

5．抗體過多引起非特異性結合

解決方案：一般目的蛋白直接的binding比較穩固時，減少抗體的使用量，具體可以參考直接的推文。

6．蛋白樣品中蛋白濃度過高（尤其是在細胞系上轉染過表達兩種蛋白質）

解決方案：用裂解液適當地稀釋蛋白樣品，或者可以選擇目的蛋白有表達的細胞系，不做轉染，直接收蛋白做IP。

7．IP過程中抗原降解

在裂解液中一定要加入適當的蛋白酶抑制劑，尤其是對于含多個基團（如糖基化）的蛋白，更應當注意在冰上操作和4度離心。

相反，大家可能還會遇到一個問題，那就是沒有檢測到目的蛋白，原因如下：

1．用的細胞或者組織樣品中本身不表達或者低表達這個蛋白，可以換一種該蛋白高表達的細胞系或者組織，重新進行IP

2．抗體量加的太少，導致不能結合到更多的抗原，應當增加抗體濃度。

3．目的蛋白沒有從珠子上洗脫下來，此時，首先應確定洗脫緩沖液的質量是否良好，另外可以嘗試其他的洗滌劑。

4．抗體沒有結合到珠子上，此時，應當確保使用的珠子與抗體亞型是一致的。

5．細胞或組織沒有裂解完全，或者完全沒有裂解。此時，應當檢查裂解液是否已經失效，可以重新配置，再進行IP。

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