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多種PCR方法介紹

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2018-12-27 16:28:32

想必在每個(gè)學(xué)生物的人眼中PCR這個(gè)詞絕對(duì)不陌生，簡(jiǎn)單的描述為：幾個(gè)東西加一起，混一混，上個(gè)PCR儀就可以坐等產(chǎn)物了?？雌饋韘o easy，但想成就PCR不敗記錄，擴(kuò)增出各種不同序列，并且擴(kuò)出來的條帶特異性良好，還是需要點(diǎn)功夫的，今天我們就來介紹一下簡(jiǎn)單又不簡(jiǎn)單的各種PCR吧！

高GC含量PCR（GC-rich PCR）

具有高GC含量（>80%）的模板由于G和C堿基間的強(qiáng)氫鍵影響，比較難以擴(kuò)增。高GC含量序列同時(shí)也涉及二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，高GC含量序列使DNA聚合酶在擴(kuò)增時(shí)卡住，從而影響了DNA的合成。

為了擴(kuò)增高GC含量片段，雙鏈模板必須分離，以便引物結(jié)合及DNA聚合酶讀取序列。為了克服強(qiáng)GC相互作用，最常用的方法是依靠PCR添加劑或共溶劑來幫助DNA變性，如DMSO。這些試劑通常會(huì)降低引物的Tm，所以退火溫度也需做相應(yīng)的調(diào)整。

高合成能力的DNA聚合酶由于其與模板的強(qiáng)結(jié)合能力，有助于高GC含量模板的PCR擴(kuò)增。高熱穩(wěn)定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR擴(kuò)增，因?yàn)楦叩淖冃詼囟?，?8℃代替95℃，可促進(jìn)解鏈和PCR擴(kuò)增。

長(zhǎng)片段PCR（Long PCR）

長(zhǎng)片段PCR通常指擴(kuò)增大于5 kb的DNA片段。長(zhǎng)片段PCR傳統(tǒng)上使用Taq DNA聚合酶（為了快速延伸）和高保真酶（為了準(zhǔn)確度）的混合物。

隨著高合成能力、高保真DNA聚合酶的發(fā)明，長(zhǎng)片段PCR現(xiàn)在可在短時(shí)間內(nèi)高準(zhǔn)確性的完成。通過與一個(gè)強(qiáng)DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合，聚合酶可獲得高擴(kuò)增能力，可在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增長(zhǎng)片段，如>20 kb gDNA片段。除此之外，極高保真度，如>100xTaq，可確保長(zhǎng)片段擴(kuò)增的低錯(cuò)誤率。

當(dāng)擴(kuò)增>10 kb的片段時(shí)，PCR實(shí)驗(yàn)方案可能需要在以下5個(gè)關(guān)鍵位置進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化：

1. 確保使用高質(zhì)量、高純度的DNA樣本。

2. DNA聚合酶的熱穩(wěn)定較低，使用更多量的DNA聚合酶以彌補(bǔ)多次循環(huán)中的聚合酶活性損失。

3. 降低退火和延伸步驟的溫度，以助于引物結(jié)合。

4. 適當(dāng)增加PCR步驟的時(shí)間，以促進(jìn)模板DNA的完全分離及引物的結(jié)合。

5. 適當(dāng)增加PCR延伸時(shí)間確保目的片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增。

熱啟動(dòng)PCR（Hot Start PCR）

熱啟動(dòng)PCR常用于增強(qiáng)PCR擴(kuò)增的特異性。熱啟動(dòng)PCR主要借助一種酶的修飾物，如抗體、親和配體、適體或化學(xué)修飾物，來抑制常溫下DNA聚合酶的活性。這種修飾使得在PCR反應(yīng)體系配制階段引物與模板、引物與引物之間的結(jié)合能力降低，從而避免了非特異性擴(kuò)增。由于DNA聚合酶在常溫下的活性被抑制，熱啟動(dòng)技術(shù)為在常溫下配制多個(gè)PCR反應(yīng)體系提供了極大的便利，而無需犧牲PCR反應(yīng)的特異性。當(dāng)反應(yīng)體系配制好后，在反應(yīng)初始加熱時(shí)，酶修飾物在高溫下（通常高于90 ℃）被釋放，使得DNA聚合酶被激活。激活時(shí)間和溫度根據(jù)DNA聚合酶及熱啟動(dòng)修飾物的不同而有所差別。對(duì)于某些聚合酶，激活和預(yù)變性合并成了一步。

降落PCR（Touchdown PCR）

另一種提升PCR反應(yīng)特異性的方法是調(diào)整PCR循環(huán)的參數(shù)。在降落PCR中，前幾個(gè)循環(huán)的退火溫度設(shè)定為比引物的最高退火溫度（Tm）再高幾度。較高的溫度有助于避免產(chǎn)生引物二聚體及非特異性引物與模板形成的復(fù)合物，因此可以減少不希望出現(xiàn)的擴(kuò)增。就這一點(diǎn)來說，較高的退火溫度可減少非特異性PCR產(chǎn)物，在PCR起始階段促進(jìn)特異性的擴(kuò)增。

雖然較高的退火溫度可阻止引物二聚體形成和非特異性引物結(jié)合，但同時(shí)較高的退火溫度會(huì)加劇引物與目標(biāo)序列的分離，導(dǎo)致PCR的產(chǎn)量降低。為了克服這個(gè)問題，在開始的幾個(gè)循環(huán)中，退火溫度通常設(shè)置為每個(gè)循環(huán)降低1℃，以獲得足量的預(yù)期擴(kuò)增子。當(dāng)退火溫度降低到最佳溫度時(shí)（通常比最低的引物Tm低3-5℃），剩余的循環(huán)都維持此退火溫度。通過這種方法，在PCR過程中，所期望的PCR產(chǎn)物得到有選擇性的增加，而幾乎不會(huì)出現(xiàn)非特異性的產(chǎn)物。

巢式PCR（Nested PCR）

巢式PCR是常規(guī)PCR的一種演變，其增強(qiáng)了反應(yīng)特異性和目標(biāo)擴(kuò)增子的產(chǎn)量。在此方法中，需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：一對(duì)（外引物）在目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域的側(cè)翼，而另一對(duì)引物（巢式引物）對(duì)應(yīng)于所擴(kuò)增DNA的準(zhǔn)確區(qū)域。第一輪PCR的產(chǎn)物之后作為第二輪PCR的模板。如果第一對(duì)引物（外引物）由于引物錯(cuò)配擴(kuò)增出了非特異性產(chǎn)物，第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低，所以通過第二對(duì)引物的擴(kuò)增，PCR的特異性得到了提升。進(jìn)行兩輪PCR的另一個(gè)好處是這種方法有助于從有限的起始DNA中擴(kuò)增得到足量的產(chǎn)物。

多重PCR（Multiplex PCR）

多重PCR可實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)不同的片段。多重PCR不僅意味著節(jié)約時(shí)間、試劑和樣本，同時(shí)使得多個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行同時(shí)比較成為可能。當(dāng)一個(gè)反應(yīng)管中存在多個(gè)引物對(duì)時(shí)，如在多重PCR中，非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增效率的降低是最關(guān)注的問題，因?yàn)榉磻?yīng)的優(yōu)化不可能針對(duì)所有的引物對(duì)和片段。因此，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，以減少錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增。

引物序列對(duì)于目標(biāo)片段應(yīng)該是獨(dú)特的，且所有引物的Tm值差異應(yīng)在5℃內(nèi)。在進(jìn)行多重PCR前，每個(gè)引物對(duì)應(yīng)在單個(gè)反應(yīng)中驗(yàn)證其特異性和擴(kuò)增效率。而且，不同大小的擴(kuò)增子應(yīng)在凝膠電泳中可區(qū)分開，以便鑒定。除了引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增子大小，熱啟動(dòng)DNA聚合酶和特殊優(yōu)化的PCR緩沖液對(duì)于多重PCR也是必需的，它們有助于擴(kuò)增的成功率和擴(kuò)增的特異性。

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