非編碼RNA在許多腫瘤發生發展的各階段的起到重要作用，是目前腫瘤研究的熱點。非編碼RNA幾乎參與了腫瘤細胞的增殖、分化、轉移。此外，非編碼RNA作為疾病標志物不斷被發現，正成為研究人員尋找相關腫瘤治療的靶標。

        長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類非編碼RNA，其長度在200nt以上，在腫瘤的發生發展中具有多種作用，它以ceRNA方式作為海綿吸附miRNA從而調控相關基因的表達，也可以協同轉錄因子激活相關基因的表達或者結合蛋白防止蛋白降解從而促進蛋白相關功能的發揮。lncRNA的ceRNA網絡研究目前已經較為普遍，這里我們將借助一篇文獻，主要從lncRNA與多種蛋白及核酸互作的角度來介紹lncRNA的功能、機制研究。

 

1. 通過模型和臨床標本尋找要研究的lncRNA—H19

        基于前期miRNA與腹部動脈瘤的相關研究結果，作者欲從長鏈非編碼入手探究其與腹部動脈發生發展關系。作者首先建立了鼠腹動脈瘤模型和迷你豬動脈瘤模型，運用lncRNA測序研究了腹部動脈瘤鼠模型、人體組織標本中穩定未破的和破裂的瘤體組織lncRNA的表達譜綜合交錯分析，發現H19是在兩種模型和人體組織中上調差異最明顯的lncRNA。

圖1 AngⅡ誘導后七天檢測的受異常調控的轉錄本的火山圖

 

2. 原位雜交、細胞增殖、凋亡及基因敲減驗證H19的定位及功能特性

        原位雜交顯示，H19主要在無病組織的中層平滑肌細胞（SMC）和外膜成纖維細胞中表達，血管緊張素II（AngII）刺激后H19在中層血管平滑肌細胞中表達增加，說明H19通過影響血管平滑肌細胞的動力學參與腹動脈瘤發生發展。

        細胞增殖實驗顯示AngII可以促進SMC細胞的凋亡，降低細胞的增殖速率，同時，AngII可以提高H19的表達，H19的敲減可以抑制AngII的功能作用。對H19做進一步研究發現，過表達H19可以促進SMC細胞的凋亡，而敲減H19可以抑制細胞的凋亡，但是H19的表達變化對細胞的增殖沒有影響。

 

圖2 H19敲低和過表達對腹動脈瘤和血管平滑肌細胞生長、增殖和凋亡的影響

 

3. H19不是通過miR-675的剪切表達調控SMC細胞的功能

         miR-675在H19的第一個外顯子上，前期研究表明H19可以剪切表達miR-675，通過miR-675發揮調控作用。這里作者對H19是否通過miR-675發揮作用進行了研究，通過構建缺失miR-675表達載體，與野生型共轉染到SMC細胞中，野生型和缺失突變型均誘導了細胞的凋亡。同時，在組織樣本和AngII誘導的腹動脈瘤模型中均未檢測到miR-675的顯著差異表達。說明H19不是通過miR-675來調控SMC的凋亡的。

圖3 miR-675缺失突變型和野生型的H19均誘導細胞凋亡抑制細胞增殖

 

4. H19調控SMC表達的途徑

        作者接著從轉錄因子入手，通過生信分析，篩選出了幾個可以和H19互作的轉錄因子，分別為CREB1（cAMP responsive element binding protein 1）、TFCP2（transcription factor CP2）、GTF2IRD1（GTF2I repeat domain containing 1）、SMAD4（SMAD family member 4）、HIF1α、ZBTB14（zinc finger and BTB domain containing 14）、KLF11（Krüppel-like factor 11）、TFAP2α（transcription factor AP-2 alpha）。作者接著在SMC中過表達、敲低H19，用定制的RNA表達芯片檢測上述轉錄因子的表達，發現過表達H19可以促進HIF1α的表達，抑制H19可以抑制HIF1α的表達，HIF1α是唯一受調控的轉錄因子。

  

圖4 q-PCR檢測過表達和敲低H19后相關轉錄因子的表達，發現HIF1α是唯一受H19敲降或者過表達正負調控的轉錄因子

 

       如何證明是HIF1α調節H19在SMC中的發揮功能作用的呢？SMC細胞中干擾HIF1α后，HIF1α的mRNA和蛋白表達量均顯著下調，同時，促凋亡蛋白BAX也與HIF1α的表達一致，BCL-2的表達量則相反，但是H19的表達量沒有改變。相反，H19的過表達可以顯著提高HIF1α的表達。這些結果暗示了H19可能通過HIF1α來調控細胞的凋亡。

         

圖5 q-PCR檢測過表達和敲低HIF1α后凋亡相關分子的表達

 

        由于BAX是受P53調控，因此P53可能參與H19促凋亡。通過敲低P53的表達，發現P53的敲低可以顯著抑制HIF1α過表達或者AngII促進的SMC細胞凋亡，這說明P53參與了H19-HIF1α誘導的凋亡。有報道，肺癌和鼠胚胎成纖維細胞中P53是受E3泛素連接酶Mdm2（mouse 3T3 cell double minute 2）的調控。作者接著通過Co-IP及相關刺激因子誘導實驗，證實了HIF1α可以和Mdm2結合從而降低P53的泛素化，促進SMC細胞的凋亡。

圖6 CO-IP實驗證實HIF1α可以與Mdm2結合

H19、HIF1α、BAX、BCL2在人類疾病樣本和兩種鼠模型中的表達模式與上述細胞系研究中的結果相符，進一步地驗證了上述的結論。

        

    圖7 H19、HIF1α、BAX、BCL2在疾病樣本和鼠模型中的表達

 

5. H19與HIF1α在胞質中的共定位及互作

         H19有無可能直接與HIF1α互作呢？生物信息學分析顯示H19上有結合HIF1α的二級結構，作者接著采用了原位雜交、鄰位連接(PLA)技術證實了H19與HIF1α在胞質中的共定位及互作（<40nm）。

         

圖8 原位雜交、鄰位連接(PLA)技術證實H19與HIF1α在胞質中的共定位及互作

 

6. 細胞核中的H19通過與SP1及HIF1α啟動子結合促進HIF1α的轉錄

前面研究已經發現H19可以促進HIF1α的表達，那么能在細胞質中與HIF1α結合的H19能直接在細胞核中發揮調控HIF1α的作用嗎？

        已有研究發現HIF1α的轉錄依賴于轉錄因子特異蛋白1（Sp1），HIF1α啟動子區域有幾個與Sp1結合的位點，H19有可能通過影響Sp1的結合促進HIF1α的轉錄。作者接著運用ISH、PLA、螢光素酶及Sp1抑制等實驗證實了H19可以招募Sp1從而促進HIF1α的轉錄。

 

     
               

圖9 PLA、螢光素酶及Sp1抑制等實驗證實H19可能通過招募Sp1從而促進HIF1α的轉錄

 

        另一方面，通過LongTarget tool預測，H19上存在與HIF1α啟動子區結合的區域。通過去除H19相應區域，H19仍然保留它的促進細胞凋亡的作用，但是喪失促HIF1α轉錄的作用。最后，作者通過RNA-ChIP實驗進一步證實了Sp1及H19可以與HIF1α的啟動子區結合。

   

圖10 RNA-ChIP、敲除實驗進一步證實H19通過招募Sp1促進HIF1α的轉錄

 

        總結：同其他文章相比，本文的特色是通過生物信息學、分子互作技術對H19促進SMC細胞凋亡的功能作了研究。在細胞質中，H19通過與HIF1α結合招募Mdm2降低P53的泛素化，從而促進SMC細胞的凋亡，促進腹動脈瘤的進展；在細胞核中，H19通過與HIF1α啟動子區結合，同時招募Sp1到啟動子區，從而促進HIF1α的轉錄，促進SMC細胞的凋亡，最后促進腹動脈瘤的進展。本文對H19的功能作了一個詳實而全面的研究，為研究疾病相關的長鏈非編碼RNA提供了一定的思路。

 

參考文獻：

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3. Huang Y, Zheng Y, Jia L and Li W. Long Noncoding RNA H19 Promotes Osteoblast Differentiation Via TGF-beta1/Smad3/HDAC Signaling Pathway by Deriving miR-675. Stem Cells, 2015;33:3481-3492.

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