柱層析設備

        柱層析的基本原理是將一份蛋白質混合物分成很多小份，從而使某些組分中目標蛋白的濃度通過濃縮得以增大。雖然已經有很多昂貴和特殊的設備可用于柱層析，但實際上它只需要最基本的設備即可。

 

基本柱層析設備

固定相：一種惰性介質, 通常帶有一種可促進蛋白質相互作用的官能團以進行蛋白質分離。固定相和官能團的選擇取決于層析色譜和方法的種類。

柱子：一種圓柱形玻璃容器，長度和直徑各不相同。柱子可以直接購買已填裝固定相能直接連接到層析設備上使用的預裝柱（參見本章第2部分），或可購買空柱自己手動填裝。自動層析設備和人工重力柱使用的是不種類型的柱子。

 

溶劑：含有添加劑的緩沖液，作為將蛋白質在固定相上平衡和洗脫的流動相。不同類型的柱層析需要不同的溶液條件

 

收集管：用于收集洗脫液樣品的容器。自動組分收集器需要特定的收集管。手動收集時，則試管或容器均可使用。

 

純度檢測方法：一種檢測樣品里所有蛋白質中目標蛋白相對含量的檢測手段。每一步獲得的含有目標蛋白的組分都必須在進行下一步純化工作前進行檢測。后面的章節將對一些常用的純度分析方法進行討論

 

柱層析系統

        柱層析可以依賴用泵將溶劑以固定流速打入填裝好的層析柱的自動設備（圖2）來完成或者依靠流動相的重力作用自己完成。自動系統或者重力柱系統均可與自動組分收集器連接使用。兩者都有各自的優缺點。GE Healthcare的AKTA FPLC system是目前應用最為廣泛的系統之一。

用于蛋白質自動層析分離的Äktaprime plus系統。來自GE

柱層析種類

        四種主要的柱層析類型包括親和層析、離子交換層析 （IEX）、疏水層析（HIC）和體積排阻層析 （SEC）。大部分純化過程需要用到其中一種或者多種層析方法以獲得后續應用所需純度的蛋白質產物。選擇最合適的層析方法并排序就是優化蛋白質純化工藝最關鍵的內容。

        通過對蛋白質序列進行分析，可以鑒定出其特有的性質以選擇相應的純化過程。在測定蛋白質疏水殘基伸展程度的同時，亦可測定其分子尺寸和（某特定pH值時的）電荷情況。
 

層析種類	分離蛋白的作用原理	結合部分	流動相
親和	特異性作用	無競爭配體	競爭性配體（特異性）；可破壞蛋白質間（非特異性）相互作用力的條件
離子交換	表面電荷	低離子強度	高離子強度；增加（陽離子交換）或降低（陰離子交換）pH值
疏水作用	疏水性	高離子強度	低離子強度
尺寸排阻	水力學半徑

用蛋白A、G、L進行親和層析的原理示意圖

 

蛋白質洗脫方法

        固定相上結合的蛋白質要用可破壞結合作用力的溶劑條件進行洗脫。這些流動相的條件要根據層析類型和目標蛋白質的性質來選擇。蛋白質洗脫方法通常包括以下三種：批次洗脫，階梯式洗脫和線性梯度洗脫。如何選擇最好的方法要依靠采用的層析方式和所需的分離效果來決定。

 

批次洗脫 - 一步即將所有結合蛋白質一次性洗脫?；谔禺愋韵嗷プ饔?（如親層析）的層析方法最好采用這種方式。批次洗脫法沒有任何分離效果，但它可以很好地快速去除雜質。它需要事先了解取代目標蛋白所需的緩沖液條件。

 

階梯式洗脫 - 連續進行多步批次洗脫，并每次逐漸增強洗脫條件。在階梯式洗脫中，收集的組分數取決于連續批次洗脫的次數。階梯式洗脫比批次洗脫的分離效果要好，但比線性梯度洗脫的效果要差。

 

線性梯度洗脫 - 當流動相以線性梯度洗脫時可收集多種連續流出的組分。對于離子交換層析和疏水作用層析，線性梯度洗脫可以獲得最好的分離效果，同時，它還可以收集到大量的連續組分。

        由于體積排阻層析中蛋白質和固定相之間不存在相互作用，因此不需要采用任何一種上述洗脫方法。蛋白質上樣后，無需改變洗脫緩沖液的條件，即可連續不斷地收集各分離組分至所有蛋白質全部被洗脫為止

        理想的情況是這根層析柱所采用的洗脫緩沖液同樣可用于后續的層析柱，由此可省去兩步之間必須的緩沖液置換或者透析操作。

 

高通量蛋白純化

        在如今的后基因組學時代，對用于結構測定和藥物發現/化合物篩選目的的高通量蛋白純化大有興趣存在。為了篩選寬范圍的構建體并為最佳的最終用途選擇一個或多個，研究人員已經利用了一系列可商購獲得的自動化/機器人系統，其能夠快速，平行，（半）自動化純化親和標記蛋白。蛋白質的基本原理仍然適用; 液體處理機器人/自動平臺的簡單是的流線化和凈化過程的加速成為可能。

 

膜蛋白

        細胞產生的約20-30％的蛋白質是整合膜蛋白，并且約50％的小分子藥物作用于膜蛋白質。因此，針對解決膜蛋白結構有極大的興趣。純化整合膜蛋白的關鍵步驟是它們從脂質雙層的溶解，同時保留其功能完整性。典型的方法包括通過離心分離細胞內膜，隨后洗滌劑溶解整合膜蛋白質并高速離心以除去不溶性膜殘余物。大量的洗滌劑已被用于膜蛋白溶解，并且在沒有文獻或實驗室先例的情況下，研究者將需要憑經驗確定某特定蛋白質的最佳洗滌劑。然后通過本質上與可溶性蛋白相同的柱色譜法純化溶解的膜蛋白。然而，純化緩沖液將需包含洗滌劑以保持蛋白質處于可溶狀態。膜蛋白的純化通常非常具有挑戰性，因為在從脂質雙層初步移除和通過各種純化步驟后蛋白質功能完整性和聚集的常常喪失。但許多研究小組已經成功地純化了足夠量的膜蛋白用于結構測定（例如結構基因組學聯盟 Structural Genomics Consortium）。近來，納米盤已經成功地用于B家族GPCR的親和純化。