題目：A time-resolved multi-omic atlas of the developing mouse stomach

小鼠胃發(fā)育過(guò)程多組學(xué)圖譜

期刊：Nature Communications

影響因子：12.353

主要技術(shù)：Label-free

研究背景

        哺乳動(dòng)物的胃結(jié)構(gòu)高度多樣化，其器官功能依賴于正常的胚胎發(fā)育。盡管已有多項(xiàng)關(guān)于胃發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化的研究，但是大多數(shù)胃發(fā)育研究都集中在一小組蛋白質(zhì)或特定途徑上，阻礙了對(duì)系統(tǒng)生物學(xué)中整個(gè)過(guò)程的理解，缺乏對(duì)潛在分子變化的全系統(tǒng)分析。

 

研究?jī)?nèi)容及結(jié)果

1. 小鼠胃發(fā)育的蛋白質(zhì)組學(xué)圖譜

        為了繪制發(fā)育中的小鼠胃的蛋白質(zhì)組圖譜，作者選擇了15個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集小鼠胃樣品，覆蓋胚胎期（E12.5即胚胎第12.5天、E13.5、E14.5、E15.5、E16.5、E17.5和E18.5）、產(chǎn)后天（D1、D3、D5）和產(chǎn)后周（W1、W2、W3、W6、W8），每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)（圖1a）。作者使用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)共鑒定到12108種蛋白質(zhì)。一般而言，管家蛋白，例如TUBB4B和HSP90B1，在整個(gè)發(fā)育階段表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達(dá)，在對(duì)數(shù)變換后，蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度（iFOT）跨越約8個(gè)數(shù)量級(jí)，這反映了胃蛋白質(zhì)組的高度動(dòng)態(tài)性質(zhì)（圖1e）。作者選取了2890種蛋白質(zhì)代表胃蛋白質(zhì)組的核心組分，這些蛋白質(zhì)的功能在多種途徑中顯著富集，包括代謝、剪接體、蛋白質(zhì)加工和其他途徑（圖2）。

圖1 小鼠胃發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)

 

圖2 核心蛋白KEGG分析

2. 小鼠胃發(fā)育的三個(gè)不同階段

        蛋白質(zhì)機(jī)制的變化決定了器官發(fā)生和發(fā)育。雖然整個(gè)發(fā)展過(guò)程是逐漸發(fā)生變化的，但在某個(gè)關(guān)鍵階段會(huì)發(fā)生顯著變化。為了在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上研究這些變化，作者進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督層次聚類分析（HC）和主成分分析（PCA），發(fā)現(xiàn)兩種分析方法都將實(shí)驗(yàn)劃分為三個(gè)明顯不同的階段：Ph1 （E12.5-E16.5），Ph2 （E17.5-W2）和 Ph3 （W3–W8）（圖3a）。為了鑒定每個(gè)階段的代表性蛋白質(zhì)并了解它們的生物學(xué)意義，作者對(duì)三個(gè)階段的4300個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了蛋白質(zhì)共表達(dá)分析和KEGG分析（圖3b，c）。KEGG分析表明Ph1與細(xì)胞分裂有關(guān)。Ph1具有最多的差異表達(dá)蛋白，主要參與剪接體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期和嘧啶代謝等通路途經(jīng)（圖2c）。Ph2涵蓋圍產(chǎn)期和哺乳期，是胃在形狀和質(zhì)量上增長(zhǎng)最快的階段，Ph2具有最少數(shù)量的高表達(dá)蛋白質(zhì)，富含ECM-受體相互作用、溶酶體和粘著斑（圖2c）。Ph3是成熟期，胃已經(jīng)獲得代謝功能，當(dāng)嬰兒小鼠斷奶（出生后20-22天）并開始吃食物36時(shí)，Ph2和Ph3之間的邊界位于W3。

圖3  小鼠胃三個(gè)發(fā)展階段及其生物功能

3. 胃發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵胃蛋白的動(dòng)態(tài)變化

        作為主要的消化器官，胃產(chǎn)生許多消化酶，因此，作者追蹤了胃發(fā)育過(guò)程中三個(gè)重要的胃蛋白酶原（CYM、PGA5和PGC）的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化（圖3d）。CYM和PGA5在Ph2中高度表達(dá)，PGC僅在Ph3中檢測(cè)到。Ph2中的小鼠以牛奶為食，高水平的CYM和PGA5表明它們可能在乳蛋白消化中起重要作用。W3期檢測(cè)到PGC，并且其在W3后維持在高水平，這一發(fā)現(xiàn)與已報(bào)道的PGC在成人胃中表達(dá)結(jié)果一致。胃蛋白酶原在胃質(zhì)子泵產(chǎn)生的酸性環(huán)境中被激活，胃質(zhì)子泵是存在于胃泌酸粘膜壁細(xì)胞中的H+/K+-ATP酶，它有兩個(gè)亞基（ATP4A和ATP4B），是介導(dǎo)酸分泌的離子傳輸系統(tǒng)的關(guān)鍵部件之一。ATP4A和ATP4B的表達(dá)水平在Ph2中同時(shí)增加并在Ph3中達(dá)到峰值（圖3d），標(biāo)志著隨著小鼠胃成熟，壁細(xì)胞在Ph2和Ph3中的形成和成熟。

在胃中高度表達(dá)的其他蛋白質(zhì)（ANXA10、CLDN18、CTSE、GHRL、GIF、TFF1和VSIG1）維持正常的胃功能（圖4）。其中，GIF是由胃主細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白；ANXA10是在胃粘膜中表達(dá)的鈣和磷脂結(jié)合蛋白；VSIG1是腺體胃上皮細(xì)胞正常分化所需的細(xì)胞粘附蛋白；CLDN18是胃上皮相關(guān)的密蛋白。在發(fā)育的Ph3中這些蛋白質(zhì)的逐漸增加表明它們可能是成熟胃的標(biāo)志物。

圖4  七種胃蛋白在小鼠胃發(fā)育中表達(dá)變化

4. 差異表達(dá)剪接異構(gòu)體

        基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析的同時(shí)，作者還在相同時(shí)間點(diǎn)的小鼠胃組織上進(jìn)行高通量RNA-Seq分析，兩個(gè)數(shù)據(jù)集同時(shí)鑒定到10994個(gè)基因。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的無(wú)監(jiān)督層次聚類分析（HC）和主成分分析（PCA）將整個(gè)小鼠胃發(fā)育過(guò)程分成兩個(gè)階段（圖5a）。該分類幾乎完全與從蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)獲得的3個(gè)階段重疊，僅有與基于轉(zhuǎn)錄組的分類的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)（E17.5）差異。這些觀察結(jié)果表明，基于蛋白質(zhì)或RNA表達(dá)水平，從E12.5到W8的發(fā)育過(guò)程可大致分為三個(gè)階段。半監(jiān)督層次聚類分析基于其時(shí)間表達(dá)模式將基因分為四組（圖5b），第一階段差異表達(dá)的大多數(shù)基因富含幾種途徑，例如剪接體、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞周期（圖5c）；第二階段包含兩個(gè)參與粘著斑、ECM-受體相互作用，幾種信號(hào)傳導(dǎo)途徑和脂肪酸或氨基酸降解的基因組；第三階段主要與氧化磷酸化和代謝活動(dòng)有關(guān)。總體而言，基于RNA-Seq的聚類分析揭示了三個(gè)階段，與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)獲得的生物學(xué)特征有相似性。

        前人研究揭示了剪接異構(gòu)體在各種生物過(guò)程中的作用，如器官發(fā)育，當(dāng)通過(guò)FPKM≥1過(guò)濾時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)7769個(gè)基因的24346種剪接異構(gòu)體，其中2989種異構(gòu)體在三個(gè)階段（基于RNA-Seq的聚類）差異表達(dá)，在這些通路調(diào)節(jié)因子或轉(zhuǎn)錄因子中，并非所有剪接異構(gòu)體都發(fā)生顯著變化，其中一些變異體在mRNA水平上沒有或非常低表達(dá)（圖5d）。這些結(jié)果表明，只有一小部分剪接異構(gòu)體在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)，并且在功能上與胃發(fā)育有關(guān)。

圖5  小鼠胃發(fā)育轉(zhuǎn)錄組學(xué)

5. 胃發(fā)育與胃癌的相關(guān)性

        作者收集84名彌漫型胃癌患者白質(zhì)組數(shù)據(jù)集，在蛋白質(zhì)組水平上研究胃發(fā)育和胃癌的相關(guān)性。作者用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分別鑒定到241和725個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，發(fā)現(xiàn)在與器官發(fā)育和癌癥相關(guān)的充分表征的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子中。當(dāng)細(xì)胞處于快速分裂和增殖時(shí)，它們中的大多數(shù)在早期胚胎階段（Ph1）中更高表達(dá)，例如CDX2是胃癌的預(yù)后標(biāo)志物，其RNA在胃發(fā)育的早期階段升高。

在胃發(fā)育的八個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路中的蛋白質(zhì)或基因中，有大量蛋白質(zhì)或基因在胃發(fā)育三個(gè)階段中差異表達(dá)（圖6）。大部分這些基因在彌漫型胃癌（DGC）也是差異表達(dá)或突變基因。如Wnt信號(hào)通路中的WNT5A顯著上調(diào)，而Apc和Ctnnb1在DGC中突變。胃發(fā)育和DGC中這些調(diào)節(jié)因子的改變清楚地表明，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和胃癌中的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的失調(diào)。

為了進(jìn)一步將胃發(fā)育與胃癌的信號(hào)通路水平相關(guān)聯(lián)，作者進(jìn)行雙尾超幾何統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)以確定在胃發(fā)育和DGC之間的特定途徑上是否存在改變的基因產(chǎn)物顯著重疊。發(fā)現(xiàn)除hedgehog信號(hào)通路外的所有途徑均表現(xiàn)出高度相關(guān)性（-log10P-value >3）（圖7a），表明胃發(fā)育和胃癌的發(fā)生可能是兩個(gè)相關(guān)的過(guò)程。為了獲得DGC中鑒定的上調(diào)蛋白在胃發(fā)育中表達(dá)的全局視圖，作者將939種腫瘤差異表達(dá)的蛋白質(zhì)映射到小鼠胃發(fā)育期間的15個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn) Ph1 鑒定出蛋白質(zhì)的百分比明顯高于后期時(shí)間點(diǎn)（圖6b）。這說(shuō)明胃癌與胚胎胃發(fā)育具有許多共同特征，并且該疾病可能由轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的失調(diào)引起。

圖 6 涉及胃發(fā)育和胃癌的關(guān)鍵信號(hào)通路

 

圖7  胃發(fā)育與胃癌相關(guān)性分析

 

文章小結(jié)

        作者描繪了小鼠胃發(fā)育過(guò)程蛋白質(zhì)和 mRNA 水平全景圖，確定了胃發(fā)育過(guò)程中三個(gè)不同階段。將蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合在一起，檢測(cè)和驗(yàn)證可能對(duì)胃發(fā)育有根本影響的可變剪接轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)比較胃發(fā)育的蛋白質(zhì)組學(xué)特征與彌漫型胃癌的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)顯著數(shù)量的途徑調(diào)節(jié)因子，特別是在DGC中上調(diào)或經(jīng)常突變的轉(zhuǎn)錄因子，在胃發(fā)育期間也差異表達(dá)，證明了胃癌和胃發(fā)育之間存在相關(guān)性。

 

解析文獻(xiàn)

Xianju Li, Chunchao Zhang, et al. A time-resolved multi-omic atlas of the developing mouse stomach[J]. Nature Communications, 2018, 9:4910.

 

相關(guān)服務(wù)

        Label-free是通過(guò)比較質(zhì)譜分析次數(shù)或質(zhì)譜峰強(qiáng)度，分析不同來(lái)源樣品蛋白的數(shù)量變化，認(rèn)為肽段在質(zhì)譜中被捕獲檢測(cè)的頻率與其在混合物中的豐度成正相關(guān)。Label-free定量不需要對(duì)比較樣本做特定標(biāo)記處理，只需要比較特定肽段/蛋白在不同樣品間的色譜質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)便可得到樣品間蛋白表達(dá)量的變化，通常用于分析大規(guī)模蛋白鑒定和定量時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

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